指甲電子順磁共振(EPR)波譜解析的數(shù)學模擬研究

閻長鑫，劉玉連，焦 玲，張文藝

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192)

隨著核能利用的增加，核與輻射帶來的潛在危害也在增長。在事故發(fā)生時快速、有效的回顧性劑量測定也就變得更加重要[1]。電子順磁共振[2-3](electron paramagnetic resonance，EPR)譜是評估吸收劑量方法之一，它是基于對輻射引起的生物或物理效應的分析。這些效應會產(chǎn)生相應的自由基，這些自由基的濃度取決于吸收劑量。人體中的牙齒、骨骼和指甲經(jīng)過輻照后都會產(chǎn)生相應的自由基。其中牙齒和骨骼中的碳酸羥基磷灰石因輻射產(chǎn)生的自由基十分穩(wěn)定，長達107a之久。但牙齒與骨骼的處理較復雜，且會對取材者造成一定的傷害，所以研究者一直在尋找可以替代牙齒、骨骼的材料。指甲作為非侵入、收集方便的一種生物材料，得到研究者的關(guān)注[4]。

指甲中含有大量的α角蛋白[5]，當受到電離輻射的時候會產(chǎn)生自由基，EPR圖譜中，指甲中自由基的含量(濃度)可由圖譜二次積分(所圍面積)來表示，即自由基濃度越高，圖譜所圍成的面積越大，因此可以利用兩者的關(guān)系來進行劑量估算[6]。

指甲受到電離輻射后，會產(chǎn)生輻射誘發(fā)信號(radiation-induced signals，RIS)，根據(jù)其產(chǎn)生原理不同分別將其命名為RIS1～RIS5。人體的受照劑量一般不會超過50 Gy，因此我們只對兩個較低劑量區(qū)的RIS感興趣，RIS2與RIS5。但是并非只有電離輻射會在指甲中產(chǎn)生自由基，Chandra H等[7]發(fā)現(xiàn)剪切后的指甲EPR圖譜顯示：“剪切”產(chǎn)生了信號，并將其命名為機械誘發(fā)信號(mechanically-induced signals,MIS)，即剪切信號。由于部分MIS信號與RIS信號位置相同(g值一樣)或是在其附近，在EPR圖譜中會重疊在一起。對于利用RIS信號進行劑量估算來說，MIS是一個干擾信號，應將MIS信號除去。除了上述RIS與MIS信號外，其他信號被稱為本底信號(background signal,BKG)。完成估算的重點在于將RIS從重疊在一起的信號中分離出來，與劑量建立關(guān)系，映射到坐標軸上建立劑量回歸曲線。Romanyukha 等[8]比較了各種去除MIS的化學方法，相比之下，D，L-二硫蘇糖醇處理效果比較好。王宏力等人[9]比較了靜置法、浸泡法、毛刷法和濾紙法，提出用潮濕濾紙包裹指甲去除MIS效果最佳。趙徵鑫等[10]給出了劑量重建中誤差來源的分析，張騰達等[11]給出了定量測量理論，為劑量定量分析和劑量回歸曲線的建立提供了基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的估算方法是將照射已知劑量EPR譜線減去未照射劑量EPR譜線(0 Gy)，達到去除本底的目的，將其差值作為受照劑量譜線，并對譜線的峰峰值進行計算，將其對質(zhì)量與標樣(g-marker)峰峰值做歸一化處理，此方法稱為譜減法。本研究提出擬合法即通過數(shù)學模擬的方法解譜以去除本底來降低誤差，這種研究方法將輻照后指甲EPR信號視為由BKG與RIS兩種信號疊加，利用數(shù)學模型來模擬BKG與RIS得到兩個模型函數(shù)，這兩個模型函數(shù)通過線性組合來擬合EPR信號。本研究同時對RIS不同組成進行了模擬，包括RIS2+RIS5和只有RIS5的兩種情況。對于每一個受到已知劑量照射的指甲EPR譜，通過擬合計算出BKG與RIS在受照波譜中的面積占比，其中RIS面積占比用來表征吸收劑量，即從受照波譜中去除了BKG，建立劑量與RIS面積占比的回歸曲線。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用指甲樣品3組來自天津市(2男，1女，年齡20～55歲之間)，對其編號為A、B、C；2組來自河北省(每組約10人混合指甲，平均年齡40歲)，編號為D、D-RIS5。使用同一把指甲刀進行剪切，剪切后儲存在-18 ℃冰箱中或立即處理。

1.2 樣品處理

(1)實驗1——RIS2+RIS5的EPR波譜分析實驗

對收集的4組樣品(A、B、C、D)進行剪切，尺寸為2 mm×2 mm，同一個人的十個手指的指甲隨機分成8份，每一份約20 mg，剪切后全部混合以20 mg為標準取8份，其余樣品放于冰箱保存留用于其他實驗。因為濕濾紙包裹后，會出現(xiàn)指甲粘在濾紙上的現(xiàn)象，不方便轉(zhuǎn)移，本文直接在小燒杯中用蒸餾水對樣品浸泡10 min，去除剪切信號(MIS)，使用真空干燥箱(予華 DZF-6050型)對其進行干燥，條件70 ℃，-0.1 MPa,干燥1 h，用于去除由于浸泡指甲所引入的水，并對水處理后的樣品進行稱重處理，稱重后對每組7份樣品進行照射，每組預留一組作為本底對照(記為0 Gy)，照射后記錄其EPR波譜。

(2)實驗2——RIS5的EPR波譜分析實驗

收集10人混合指甲，編號D-RIS5，以每份30 mg，分為13份，12份進行照射,剩余一組作為本底(0 Gy)，照射后將13份樣品進行剪切，尺寸2 mm×2 mm，蒸餾水浸泡10 min,真空干燥1 h,樣品處理后進行EPR測量，模擬真實照射事故場景下的劑量分析(即：照射后再剪碎)。

1.3 樣品照射

將樣品放入透明自封袋中用137Cs源根據(jù)不同實驗要求在室溫下進行照射。放射源使用的是加拿大Gammacell-40型137Cs伽馬射線源(劑量率為0.88 Gy/min)，均勻照射，放射源有出廠標定且每年進行實驗驗證。對于實驗1中A、B、C、D中每組7份樣品分別照射1，2，3，5，8，10，50 Gy。對于實驗2的D-RIS5組12份樣品分別照射5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60 Gy。

1.4 樣品EPR測量

本次研究采用的儀器是德國布魯克公司生產(chǎn)的X波段的電子順磁共振波譜儀(型號為A300)。定量研究采用ER 4119HS-2100 marker accessory作為標樣，以相對信號面積進行分析。實驗具體條件：中心磁場3 530 G，掃場寬度150 G，調(diào)制頻率100 kHz，調(diào)制幅度5 G，時間常數(shù)40.96 ms，掃描次數(shù)10，微波功率1.01 mW，掃場時間83.89 s，實驗溫度24 ℃左右，相對濕度40%。

1.5 模擬方法

用于模擬的基本函數(shù)為高斯函數(shù)的一階微分：

式中，A為峰峰值的一半；X0為函數(shù)中心(磁場中心，可通過,g=0.714 477 36×v(MHz)/X0轉(zhuǎn)換為g值,其中v為頻率)；Hpp為線寬；X為譜圖橫坐標即磁場值，單位均為G。模擬時通過原圖譜提供A、X0、Hpp初始值用于后續(xù)迭代，三個數(shù)值越接近原譜線真實值迭代次數(shù)越小，所用時間越少。

用該函數(shù)來分別模擬預留本底(0 Gy)與50 Gy(對于實驗2為60 Gy)的高劑量圖譜，預留本底(0 Gy)模擬結(jié)果作為純凈本底的模型函數(shù)記為LBKG，50 Gy模擬結(jié)果作為只有RIS信號的模型函數(shù)記為LRIS，LRIS的模擬選用高劑量的原因是因為在高劑量條件下可忽略本底影響而將其模擬結(jié)果作為純RIS模型函數(shù)，此處出于人體實際受照情況選用50 Gy(實驗2為60 Gy)。得出兩個模型函數(shù)后，對于受到已知照射劑量譜圖都可通過LBKG與LRIS的線性疊加表示，即F=A0×LBKG+B0×LRIS，其中F為已知劑量圖譜函數(shù)，A0，B0分別為LBKG和LRIS的面積貢獻。對于吸收譜線(高斯函數(shù))的面積計算可通過高斯函數(shù)一次微分中參數(shù)進行計算，Dy為峰峰值(波峰縱坐標與波谷縱坐標的差值)，S為吸收譜線的面積：

S∝Dy×Hpp2

1.6 模擬流程

利用布魯克Acquisit軟件獲取樣品EPR圖譜，測得圖譜以ASC文件導出。在Windows 10 平臺利用免費的Visual Studio 2019社區(qū)版作為開發(fā)IDE處理ASC文件，程序語言選用C++。畫圖利用平臺調(diào)用Python的matplotlib[12]。

模擬流程如圖1所示。將實驗得到的圖譜保存為ASC文件，將文件導入程序，程序先對未照射樣品(0 Gy)圖譜進行模擬，先提取圖譜的特征部分，包括信號的峰-峰值(Dy)，線寬(Hpp)，以g=2.005，Dy，Hpp為非線性最小二乘(Levenberg-Marquardt)的輸入，通過高斯函數(shù)的一階微分對未照射樣品的波譜進行模擬，得到LBKG(理論本底波譜)；以同樣方式模擬高劑量波譜(實驗1為50 Gy,實驗2為60 Gy)，得到理論高劑量波譜(LRIS)，將兩個理論波譜進行保存，為之后的模擬做準備。

圖1 模擬流程圖

將每組樣品中除0 Gy與50 Gy(實驗2為60 Gy)的圖譜分別導入程序中，對于每個波譜提取波譜頻率、g-marker(標樣)的面積(SM)、樣品質(zhì)量(m)和樣品劑量(后兩項存儲在圖譜文件名中)，并在組內(nèi)按照劑量從小到大進行排序，按照每個波譜的頻率在g=2.005的位置產(chǎn)生之前保存好的LBKG，LRIS，并利用公式F=A0×LBKG+B0×LRIS對其進行非線性最小二乘擬合。B0乘吸收譜線面積(Ss)對質(zhì)量和SM進行歸一化處理得到B1，將劑量作為橫坐標，B1作為縱坐標做線性擬合，其流程如圖1所示。對于每一組樣品分別利用組內(nèi)0 Gy與高劑量得到組內(nèi)LBKG與LRIS，以消除個體差異。

為了得到較為純凈的LRIS，本實驗在選用較高劑量的同時，在構(gòu)建LRIS之后，再從LRIS中扣除LBKG，因此高劑量純凈波譜是由模擬得到的LRIS與LBKG模型函數(shù)的差值，作為新的LRIS，記為L′RIS，即L′RIS=LRIS-LBKG。

2 實驗及模擬結(jié)果

指甲經(jīng)過離體剪切和剪碎過程(方便裝入內(nèi)徑4 mm石英管中)中會產(chǎn)生MIS，而實驗研究表明水處理會消除MIS[13]。經(jīng)過水處理干燥后未照射(0 Gy)的樣品作為本底信號BKG,模擬效果最優(yōu)的波譜作為LBKG，其EPR圖譜與模擬如圖2(a)所示。經(jīng)過水處理干燥后照射50 Gy，得到高劑量波譜。50 Gy圖譜模擬及其模型函數(shù)LRIS如圖2(b)所示，圖2為示例組模擬圖，實驗組BKG與RIS的模擬參數(shù)列于表1。判斷模擬精度的標準為殘譜(實驗譜與模擬譜的差值)的平均值與標準偏差，從表1中可以看出對于B組BKG殘譜平均值占圖譜峰峰值的0.050 1%，RIS2+RIS5殘譜平均值占峰峰值0.006 90%。殘譜平均值所占比例比較小，其標準偏差只有少數(shù)超過圖譜峰峰值的10%。因為殘譜數(shù)值有正有負，取平均值會相互抵消，因此殘譜平均值較小，但標準差不會抵消，數(shù)值較大。在模擬兩個模型函數(shù)時，擬合感興趣區(qū)域在信號部分，意在得到信號部分的線型，即得到信號部分峰峰值與信號部分的線寬，因此得到的殘譜與實驗譜g-marker重合，為了消除殘譜平均值與標準偏差計算時g-marker的影響，將感興趣區(qū)域取在3 490～3 530 G之間。

圖2 示例組單人樣品的BKG與RIS(50 Gy)的EPR測量及模擬圖譜

表1 EPR波譜擬合參數(shù)

利用對應組產(chǎn)生的LBKG與LRIS作為F=A0×LBKG+B0×LRIS中的輸入，對導入的實驗波譜進行擬合，A組擬合結(jié)果如圖3所示。A組中利用B1(B1=B0×Ss/(Sm×m))與照射劑量做劑量回歸曲線(圖4)，回歸方程為y= 0.004 59x+0.035 6，R2=0.941 432，擬合誤差=0.719 Gy。其他4組的擬合結(jié)果列于表2，從表2可以看出，同一個人的指甲所做的樣品線性度較好(R2>0.9)，擬合誤差在1 Gy以下(A、B、C組)，而對于10人混合樣品，線性度相對一人組樣品線性度稍差，擬合誤差在1 Gy左右(D組)。表2中D-RIS5組為實驗2的結(jié)果，從中可以看出擬合法線性度與擬合誤差都優(yōu)于譜減法。表3給出兩種方法的A、B、C、D四組各劑量值下的相對偏差，給出數(shù)據(jù)中大部分擬合法的劑量準度優(yōu)于譜減法，只有6個點譜減法相對擬合法相對偏差更小，總體來說擬合法估算值與照射值之間偏差小于譜減法。

圖3 A組2Gy擬合圖譜

圖4 A組劑量回歸曲線

表2 EPR波譜擬合結(jié)果

表3 擬合法和譜減法與照射劑量的相對偏差1)

3 討論

在2008年突尼斯，2010年加蓬，2012年秘魯?shù)?92Ir事故[14]中，研究人員利用指甲作為生物材料對事故進行了劑量估算，事故中利用RIS5完成了回顧性劑量測定。Romanyukha[15]利用健康人的指甲建立“通用”劑量回歸曲線，這種方法利用Reyes[16]提出在保證樣品尺寸與含水量相同的條件下，樣品的劑量響應很類似，這也為快速劑量估算提供了方法。上述方法都是利用的譜減法進行估算，并沒有從波譜分解上對圖譜進行解析。而本研究通過控制水處理與照射先后順序，分別對RIS2+RIS5與RIS5從圖譜組成上進行了模擬，實驗1在水處理之后進行照射，所得輻射信號為RIS2+RIS5，而實驗2經(jīng)過照射后水處理會去除RIS2[17]，水處理操作后輻射信號只有RIS5，即所測得的圖譜信號是本底與RIS5的疊加[18]。

在實驗中，每一次測量的圖譜g值有輕微浮動，同時部分波譜也會出現(xiàn)上下浮動的情況，因此實驗中將擬合所用的高斯公式進行相應的改進，對高斯公式加入了垂直移動分量與水平移動分量，使擬合結(jié)果更加完善。而對于D-RIS5的估算，預測誤差相對其他較大，在照射相差5 Gy時才能明顯看到譜圖差別，在以后的研究過程中也會探究提高探測精度的方法，為輻射事故作出更好的分型分度。同時由于指甲樣品在磁場方向上的各項異性原因，可考慮將樣品分3個角度進行測量，測量后取平均值來消除各向異性的影響。對于多人D-RIS5組擬合法與譜減法的劑量估算準確性列于表4，擬合法只有少數(shù)劑量點優(yōu)于譜減法，分析其原因可能是由于60 Gy與0 Gy信號區(qū)分度并不是很大，60 Gy峰峰值約是0 Gy的2倍，扣除后近似1∶1進行擬合，所以擬合效果沒有其余4組好。雖然可以繼續(xù)提高RIS5的照射劑量，但是文獻[17]指出RIS5在28 Gy到60 Gy之間存在飽和,繼續(xù)增加劑量譜線將成下降趨勢，更加難分辨RIS5與本底。

表4 D-RIS5組擬合法和譜減法與照射劑量的相對偏差

4 總結(jié)

本研究編程實現(xiàn)擬合法，先對兩個預設譜圖進行模擬，模擬過程中先對目標譜圖進行特征提取，包括g值、峰峰值、線寬、頻率和質(zhì)量，提取后根據(jù)峰峰值、線寬對目標進行非線性最小二乘模擬，在殘譜最小時，保存模擬得到的譜圖函數(shù)(兩個函數(shù)∶本底與高劑量)，利用模擬的兩個函數(shù)通過線性疊加擬合已知劑量圖譜，計算出高劑量函數(shù)在其中占比，再將占比乘高劑量函數(shù)面積，之后對其分別進行質(zhì)量、g-marker面積歸一化，并與劑量進行線性最小二乘擬合得出劑量回歸曲線及參數(shù)。

將EPR圖譜重疊部分進行分解一直都是波譜解析的難題，本實驗利用編程實現(xiàn)了對水處理后指甲信號的解析，相對于傳統(tǒng)的譜減法，本實驗方法從波譜組成上進行了解析，同時利用面積代替?zhèn)鹘y(tǒng)的峰峰值，減小因線寬變化所帶來的誤差，同時編程也大大縮短了計算所用的時間，節(jié)省人力。Trompier[19]指出RIS5+RIS2與劑量的線性度高達125 Gy，在本實驗中利用RIS總(RIS2+RIS5)進行估算時,在0～10 Gy范圍內(nèi)，個人樣品R2大于0.9，擬合誤差最低在0.6 Gy，多人組樣品R2接近0.9，相對誤差總體優(yōu)于譜減法。對于利用RIS5在0～60 Gy進行劑量回歸的R2大于0.9，擬合誤差4.78 Gy。

綜上，本文通過編程以高斯函數(shù)一階微分作為模型，Levenberg-Marquardt作為算法從譜線組成上對圖譜進行解析，分解出其中輻射誘發(fā)部分與已知劑量形成坐標對投射到坐標系中完成劑量估算。相對于傳統(tǒng)關(guān)心圖譜峰值的譜減法，擬合法將圖譜線型考慮在其中，對于RIS2+RIS5擬合相比于譜減法，精度與準確度較好，為指甲EPR圖譜去除本底之后做劑量估算提供了一種方法。