山藥總黃酮的提取及抗氧化活性研究

劉文全，羅 怡，朱守虎，周瑾瑞，王俊豪，張 齊

（安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽鳳陽 233100）

山藥又稱山芋、淮山、薯蕷，為多年生纏繞草本植物。山藥的原產(chǎn)地是河南焦作，現(xiàn)已在湖南、湖北、山西、云南、河北、安徽、江蘇等地廣泛種植。作為清代貢品，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，還具有抗氧化[1]、抗菌消炎[2]、抗腫瘤[3]、降血糖、降膽固醇等多種功能，屬于藥食同源食品。山藥肉質(zhì)中含有豐富的黃酮類化合物、淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、尿囊素、皂苷等多種生物活性物質(zhì)[4]。黃酮類化合物是植物代謝過程中產(chǎn)生的低分子量的二次代謝產(chǎn)物，是以2-苯基氯酮為基礎(chǔ)的化合物[5]。黃酮類化合物種類很多，多以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在，具有顯著的藥理和生理活性[6-7]，可以去除體內(nèi)的氧自由基，是一種天然的強抗氧化劑。還有改善血液循環(huán)[8]、美容保健[9]等功效。近年來，以山藥為原料生產(chǎn)加工的食品保健品，如山藥核桃奶、山藥餅、山藥糕點等深受人們喜愛，具有較高的市場價值和實用價值。

超聲波提取法[10]是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，利用超聲波具有的特性，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、增強介質(zhì)的穿透力來破壞植物藥材的細(xì)胞，從而提取出黃酮、皂苷、香豆素，木質(zhì)素和生物堿等有效成分[11]。與傳統(tǒng)有機溶劑萃取法[12]、堿溶酸沉法[13]、水浸提法[14]、酶水解法[15]等方法相比，具有萃取時間短、萃取效率高、經(jīng)濟環(huán)保且不影響提取物活性等優(yōu)點。在試驗提取和工業(yè)生產(chǎn)過程中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：山藥，購于當(dāng)?shù)厥袌觥＿x擇新鮮、無霉點、無腐爛的山藥，清洗晾干，去皮后切成小塊，于85℃下烘干后粉碎，過60目篩，制得山藥粉。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、無水乙醇、無水甲醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、抗壞血酸，均為AR；ABTS，DPPH，美國SIGMA-ALORICH提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)蘆丁樣品，用75%乙醇配制0.2 mg/mL常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL于6個25.0 mL容量瓶中，再加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，搖至混合均勻，于室溫下靜置6 min；加入10%硝酸鋁1×10-3L，搖至混合均勻，室溫下靜置6 min；向系統(tǒng)中加入4%的氫氧化鈉溶液10.0×10-3L，用75%乙醇定容至容量瓶刻度線，搖至混合均勻后靜置15 min。同時，以75%乙醇為空白對照組，用紫外分光光度計測定波長510 nm處的吸收度。以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程Y=11.682X+0.012 4，R2=0.989 5。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：Y總——山藥總黃酮的提取率，%；

V總——提取液的總體積，mL；

m——稱取的山藥粉的質(zhì)量，mg；

C——樣品中山藥黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.3 單因素試驗

采用單因素試驗研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間和超聲溫度對總黃酮提取率的影響。①乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取1 g山粉末5份，分別加入45%，55%，65%，75%，85%乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）20 mL，50℃提取2 h，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，取上清液。②料液比：稱取1 g山藥粉5份，加入85%乙醇，按1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶

1.2.2 山藥中總黃酮的測定

稱取1.0 g山藥粉，在超聲波處理機中加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇和一定的料液比，按照一定的提取時間和溫度進(jìn)行超聲波輔助提取。于轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，收集上清液，測定體積。以乙醇為空白對照，于波長510 nm處測定吸收度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蘆丁當(dāng)量，計算上清液中總黃酮含量。黃酮類化合物（Y）的提取公式如下：mL，下同）加入物料中，于60℃下提取2 h。③超聲時間：稱取1 g山藥粉5份，加入20 mL 65%乙醇，60℃下分別提取0.5，1.0，1.5，2.5，2.5 h。④超聲溫度：稱取1 g山藥粉5份，加入20 mL 85%乙醇，在40，50，60，70，80℃提取2 h。以乙醇為空白對照，在波長510 nm處測定蘆丁的體積和吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蘆丁當(dāng)量，并計算上清液中黃酮類化合物的含量。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立了四因素三水平的正交試驗。采用L（934）正交試驗優(yōu)化了山藥總黃酮的提取工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.2.5 山藥總黃酮的抗氧化活性

（1） 山藥黃酮提取液的制備。山藥干粉150 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶15，70℃下超聲提取2 h。過濾去除雜質(zhì)，減壓濃縮提取物，用蒸餾水反復(fù)蒸發(fā)，直到?jīng)]有酒精味。冷凍后，提取物備用。干燥后的樣品用75%乙醇配制成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL山藥黃酮溶液。

（2）DPPH自由基清除能力測定。取2.0 mL不同質(zhì)量濃度山藥黃酮提取物，加入100μmol/L DPPH-甲醇溶液2.5×10-3L，搖至混合均勻，于暗處靜置30 min，以雙蒸餾水為參照，在波長517 nm處測定各質(zhì)量濃度山藥黃酮的吸光度A1；用去離子水代替萃取物，在相同條件下測定吸光度A0；其他條件不變，用蒸餾水代替DPPH的條件下測定吸光度A2。陽性對照組是相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸。

清除率（I%）的計算公式為：

（3）ABTS自由基清除能力測定。取0.2×10-3L不同質(zhì)量濃度的山藥黃酮提取物，相應(yīng)加入7 mmol/L ABTS 4×10-3L，充分混勻，在室溫下反應(yīng)約6 min。用雙蒸餾水測量吸光度A1作為734 nm的參考。在其他條件不變的情況下，用去離子水代替樣品測定吸光度A0。在其他條件不變的情況下，用蒸餾水代替ABTS測定吸光度A2。以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照。

清除率（I%）的計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山藥總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

由圖2可知，提取率整體趨勢表現(xiàn)為先上升再下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%~75%時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)達(dá)到最大提取率3.84%時，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，然后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。造成該現(xiàn)象的原因可能是醇溶性雜質(zhì)的存在，在低體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下雜質(zhì)溶解較小，影響也較小，而在高體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下雜質(zhì)溶解相對較多，從而降低了黃酮類化合物的提取率。

2.1.2 料液比對山藥總黃酮提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可知，提取率整體趨勢為先上升再下降，料液比為1∶10~1∶20，總黃酮提取率隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶20時，提取率達(dá)到最大值3.15%，之后隨著料液比的增加而減少。其原因可能是隨著萃取劑質(zhì)量的不斷增加，黃酮類化合物從山藥中的溶出速率加快，黃酮提取率提高；但是，過多的提取液會導(dǎo)致黃酮飽和，污染溶液，增加后續(xù)成本，因此1∶20為最佳料液比。

2.1.3 超聲時間對山藥總黃酮提取率的影響超聲時間對提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響

由圖4可知，提取率整體趨勢表現(xiàn)為先上升后下降，超聲時間為1~2 h時，總黃酮提取率隨著超聲波時間的增加而增加；在超聲時間2 h時，最大提取率為3.42%，之后隨著超聲時間的增加而減少。造成該現(xiàn)象的原因可能是超聲提取時間較短時，殘留在山藥中的黃酮類化合物過多，沒有及時溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率較低；當(dāng)溶解時間過長時，溶解到乙醇中的黃酮類化合物在加熱條件下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有效成分失活，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

2.1.4 超聲溫度對山藥總黃酮提取率的影響結(jié)果

超聲溫度對提取率的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對提取率的影響

由圖5可知，提取率整體趨勢為先上升再下降，當(dāng)超聲溫度為40~70℃時，山藥中總黃酮提取率隨超聲波溫度的升高而增加；當(dāng)達(dá)到最大提取率3.72%時，超聲溫度為70℃，然后隨著超聲溫度的升高而降低。造成該現(xiàn)象的原因是當(dāng)溫度升高時，分子運動變得更加劇烈，黃酮類化合物溶出速率加快，提取率增加；當(dāng)溫度過高時，黃酮類化合物空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有效成分失活，降低了黃酮類化合物的提取率。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，各因素對山藥總黃酮提取率影響的大小順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時間>料液比>超聲溫度，最佳試驗組合為A3B1C3D2。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 山藥總黃酮抗氧化活性試驗結(jié)果

2.3.1 山藥總黃酮對DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基有單電子，自由基清除劑能使單電子配對，從而使溶液褪色，并可用比色法進(jìn)行測量。以維C和山藥總黃酮為研究對象，比較DPPH自由基的清除效果。

山藥總黃酮對DPPH自由基清除率的影響見圖6。

圖6 山藥總黃酮對DPPH自由基清除率的影響

由圖6可知，當(dāng)山藥總黃酮質(zhì)量濃度為0.5~3 mg/mL時，DPPH自由基清除率與山藥總黃酮質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度上升至3 mg/mL時，山藥總黃酮對DPPH自由基的清除率達(dá)到90.01%，說明山藥總黃酮對DPPH自由基有著較強的清除能力，但總體清除能力不如維C。

2.3.2 山藥總黃酮對ABTS自由基清除率的影響

ABTS自由基清除能力也是反映抗氧化活性高低的有效方法，比較山藥總黃酮和維C對ABTS自由基的清除效果。

山藥總黃酮對ABTS自由基清除率的影響見圖7。

圖7 山藥總黃酮對ABTS自由基清除率的影響

由圖7可知，當(dāng)山藥總黃酮的質(zhì)量濃度為0.5~3.0 mg/mL時，隨著山藥總黃酮質(zhì)量濃度升高，ABTS自由基的清除率也隨之增加。當(dāng)山藥總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到3 mg/mL時，ABTS自由基清除率為97.87%。在此條件下，山藥總黃酮對ABTS自由基的清除能力與維C相當(dāng)。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，確定了最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶15，超聲時間2 h，超聲溫度70℃，在此條件下山藥總黃酮提取率為3.96%。通過山藥總黃酮與維C的清除自由基能力進(jìn)行對比，說明其對DPPH自由基和ABTS自由基都有較強的清除能力。黃酮類化合物能有效清除體內(nèi)氧自由基，延緩細(xì)胞衰老，具有抗癌活性。因此，山藥產(chǎn)品的開發(fā)和功能活性的研究具有很高的社會效益和經(jīng)濟效益。