BAG-1在中耳膽脂瘤中的表達及意義*

馬亦飛 丁家秀 鮮志芃 何星辰 顧萍 喻國凍

中耳膽脂瘤是一種角化復層鱗狀上皮來源的囊樣病變，不同厚度的上皮組織堆積在基質周圍，過度角化與雜亂無章的角蛋白纖維層堆積，形成了炎癥反應包裹的囊性腫物[1]。中耳膽脂瘤具有破壞鄰近骨質的特征，并可能引起嚴重的顱內外并發(fā)癥，如迷路炎、面癱、乙狀竇血栓性靜脈炎等[2,3]，可能危及生命。因此，多年來其發(fā)病機制一直備受關注，但目前尚未明確，分子生物學機制主要有上皮細胞過度增殖、骨質破壞吸收及膽脂瘤上皮細胞凋亡的觀點[4]。骨質破壞主要有破骨細胞活化，壓力壞死，酸裂解，酶介導以及炎癥介質等理論觀點[5]，近年來的研究趨向于膽脂瘤上皮凋亡被抑制[6],提示膽脂瘤細胞與正常表皮角化細胞的內在區(qū)別可能是它們具有侵襲性并不斷擴張造成骨質破壞以及易復發(fā)的根源[5]。Bcl-2結合抗凋亡基因(BCL-2-associated athanogene 1，BAG-1)作為一種細胞凋亡相關蛋白，在肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤中都有高表達，與預后、治療效果密切相關[7,8]。但在良性病變中研究較少。本研究采用免疫組化染色的方法，檢測BAG-1在中耳膽脂瘤中的表達并研究其與膽脂瘤骨質破壞的關聯(lián)性，從細胞凋亡與骨質破壞角度探討中耳膽脂瘤的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 標本取自2019年5月～2020年1月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科頭頸外科34例后天性中耳膽脂瘤患者，均經手術治療，術中證實膽脂瘤發(fā)病部位為上鼓室，術后經病理證實。所有患者均知情同意參與研究。其中，男15例，女19例；年齡13～50歲，平均30.47歲；左耳19例，右耳15例；耳流膿史0.6～18年，1例出現(xiàn)骨膜下膿腫并發(fā)癥。根據(jù)術中所見參照Saleh等[9]對聽小骨破壞程度分級的建議分4級：O0級聽小骨完整；O1級砧骨被腐蝕、聽骨鏈中斷;O2級砧骨及鐙骨弓均破壞;O3級錘骨柄與砧骨缺如、鐙骨弓破壞。本組O0級5例，O1級8例，O2級12例，O3級9例。選取同期行清創(chuàng)縫合術的12例耳外傷患者作為對照組，所取標本部位均為外耳道軟骨段皮膚，均為外耳道軟骨段撕裂傷后再縫合需修剪掉的皮膚，對患者自身病情及愈后無影響，所有患者均知情同意且后期妥善處理。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2實驗方法 將標本常規(guī)固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。常溫下免疫組化染色，采用SP法，主要步驟：①二甲苯脫蠟，酒精梯度水化。雙蒸水洗3次，每次3分鐘。②抗原修復，用0.01 mol/L，pH7.25～7.45的檸檬酸鈉液，微波爐解凍15分鐘，雙蒸水沖洗3次，每次3分鐘，洗后孵育10分鐘。③PBS沖洗3次，每次3分鐘，滴加BAG-1多克隆抗體濃度比為1∶100，4 ℃溫度下過夜。④PBS再沖洗3次，每次3分鐘，加二抗50 μl，常溫下孵育25分鐘，再次沖洗3次，每次3分鐘。⑤顯色劑顯色5分鐘后沖洗。⑥蘇木素復染約50秒，鹽酸酒精分化，PBS返染1分鐘，脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片。⑦用已知陽性片作為陽性對照，PBS緩沖液作為陰性對照。

1.3陽性結果判定 BAG-1在中耳膽脂瘤上皮和外耳道正常上皮中陽性表達為細胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色，陰性表達為細胞不著色，或呈淺黃染色。

1.4圖文分析 采用BioMias2001高清病理圖文分析系統(tǒng)，分別對34例膽脂瘤上皮的組織切片和12例外耳道正常皮膚的組織切片的染色表達結果行定量分析。隨機選取每張切片的不重疊區(qū)域的5處陽性細胞，在200倍光鏡下，分別測每處陽性部位的平均光密度，最后取平均值作為每張組織切片的測量結果。

2 結果

2.1正常外耳道皮膚和中耳膽脂瘤上皮中BAG-1的表達對比 BAG-1在正常外耳道皮膚中弱陽性表達，主要在細胞核內，散在分布于外耳道上皮表皮層，基本不顯色，量稀疏(圖1)。BAG-1在膽脂瘤上皮中陽性表達，顯色為棕黃色或棕褐色，數(shù)量較多，顆粒狀，主要分布在膽脂瘤上皮組織的基底層、棘細胞層以及顆粒層。BAG-1在膽脂瘤上皮聽小骨破壞O0級、O1級中主要在細胞核表達，在O2級、O3級中在細胞核及胞漿內均表達，其陽性細胞數(shù)及著色強度隨級別升高而表達增加(圖2～5)。BAG-1在正常外耳道皮膚表達的平均光密度值是58.47±2.37，BAG-1在膽脂瘤上皮表達的平均光密度值是104.31±3.68，后者高于前者，差異有統(tǒng)計學意義(t=72.72,P<0.05)。

圖1 BAG-1在正常外耳道皮膚中的表達(SP×200) 圖2 BAG-1在聽小骨破壞O0級膽脂瘤上皮中的表達(SP×200) 圖3 BAG-1在聽小骨破壞O1級膽脂瘤上皮中的表達(SP×200) 圖4 BAG-1在聽小骨破壞O2級膽脂瘤上皮中的表達(SP×200) 圖5 BAG-1在聽小骨破壞O3級膽脂瘤上皮中的表達(SP×200)

2.2BAG-1在聽小骨破壞程度不同級別的膽脂瘤上皮中表達的比較及趨勢 BAG-1在聽小骨破壞O0、O1、O2、O3級膽脂瘤上皮中表達的平均光密度值分別為99.71±0.60、101.24±2.76、105.55±2.07、107.95±1.79，4級平均光密度值作方差分析兩兩比較，除O0級與O1級外，其他不同級別之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)；4級平均光密度值作方差分析趨勢性檢驗，顯示隨著聽小骨破壞程度增加，膽脂瘤上皮中BAG-1表達呈上升趨勢顯著，有統(tǒng)計學意義(F=65.928，P<0.001)。

表1 BAG-1在聽小骨破壞程度不同級別的膽脂瘤上皮組織中的表達比較

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)中耳膽脂瘤上皮細胞的凋亡明顯高于正常，膽脂瘤上皮細胞的凋亡與細胞增生不存在反向調控，而是處于被抑制的狀態(tài)，即抗凋亡[10]。細胞凋亡的減少減弱了對細胞增殖的抑制，細胞增殖超過了細胞凋亡，導致膽脂瘤上皮細胞過度增生。Huisman等[11]對活性天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3的研究證實膽脂瘤上皮細胞凋亡作用微弱；Park等[12]對凋亡抑制蛋白survivin蛋白的研究也證實膽脂瘤上皮細胞抗凋亡這一理論。

BAG-l基因是BAG基因家族的重要組成部分，能與Bcl-2蛋白結合，明顯的促進Bcl-2抗凋亡的作用，故稱為“Bcl-2結合抗凋亡基因”[13]，因其是一種新型的、獨立的細胞凋亡相關蛋白，又將其命名為“BAG-1基因表達蛋白”。BAG-1抗凋亡的途徑有多種：①與Bcl-2蛋白聯(lián)合抑制caspases凋亡通路；②結合熱激蛋白70(Hsp70)或熱激同源蛋白70(Hsc70)，不同的BAG-1亞型通過不同調節(jié)功能抑制凋亡[14]；③結合細胞生長因子(血小板生長因子受體、酪氨酸激酶生長因子受體等)形成復合物，增強其功能而抑制凋亡[15]；④活化絲氨酸/蘇氨酸激酶(RAF-l激酶)，活化后的RAF-1激酶可以激活絲裂原活化蛋白激酶，并能通過細胞外的信號調節(jié)激酶信號傳導途徑促進細胞的生長繁殖;⑤通過與多種生長因子受體結合，進而啟動一系列的胞質內的信號傳導通路，激活ras/raf/MAPK和多種轉錄因子，進而調節(jié)細胞分化或轉化，增強它的功能而抑制凋亡。本研究結果示，BAG-1在膽脂瘤上皮細胞中的表達明顯高于正常外耳道上皮(P<0.05)，說明膽脂瘤上皮細胞的凋亡被抑制，細胞增殖間接被促進，致膽脂瘤上皮細胞過度增生；BAG-1在膽脂瘤上皮組織中平均光密度值隨骨質破壞程度的加重而增加，說明BAG-l在中耳膽脂瘤的表達與骨質破壞存在一定相關性，這可能是由于膽脂瘤上皮細胞凋亡減少，使得周圍炎癥細胞、破骨細胞相對較多。這種作用主要有兩方面：一方面，炎癥細胞活化后釋放破骨細胞分化因子，與破骨細胞表面的破骨細胞分化因子受體結合，激活破骨細胞使骨吸收[16]；另一方面，在多種炎性介質作用下，使細胞核因子κB受體活化因子配基(RANKL)增多或骨保護素減少，進一步激活破骨細胞的骨質破壞作用，導致骨質破壞吸收[17]。這與Takayama等[18]和Townsend等[19]在結腸癌、乳腺癌等腫瘤中BAG-1的表達具有相似性，且認為BAG-l的表達與腫瘤的分期有關,說明膽脂瘤具有類似腫瘤的特點。

綜上所述，BAG-1在中耳膽脂瘤組織中高表達，其參與了中耳膽脂瘤上皮細胞的抗凋亡調控，且與骨質破壞之間存在相關性，但兩者間具體是通過怎樣的機制互相聯(lián)系及影響的，有待進一步研究。