滋腎排石湯對結(jié)石大鼠尿液pH值、鈣和草酸水平的影響

馬志強，左巖，張翼

(石家莊市第三醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

近年來，伴隨著人群飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)石病的發(fā)生率顯著上升[1]。2010年發(fā)展中國家的結(jié)石復發(fā)率約50%，而2015年結(jié)石復發(fā)率達75%左右[2]。泌尿系結(jié)石中草酸鈣結(jié)石是最常見的成分，其形成可能與腎小管上皮細胞的損傷有關(guān)，腎小管上皮在某些因素的作用下發(fā)生損傷，使結(jié)石成分更易于附著，而壞死的細胞進入腎小管管腔有助于晶體異相成核[3-4]。從中醫(yī)角度來講，泌尿系結(jié)石屬“石淋”、“ 血淋”、“ 砂淋”、“尿血”、“腰痛”范疇，其治療方法為清熱祛濕、行氣活血以及排石通淋[5-6]。本研究總結(jié)既往臨床經(jīng)驗，提出了通過三焦預防草酸鈣結(jié)石的形成及復發(fā)，通過建立大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，采用消食湯進行灌胃治療，探討滋腎排石湯對結(jié)石大鼠尿液pH值、鈣和草酸水平的影響，并分析其可能發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取SD大鼠72只，8～10周齡，體質(zhì)量為200～240 g，雄性，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2017-0001。

1.2 實驗方法

72只SD大鼠隨機分為滋腎排石湯組、結(jié)石組與對照組，每組各24只。滋腎排石湯組方：焦山梔10 g、赤茯苓20 g、元胡20 g、雞內(nèi)金20 g、白芍20 g、瞿麥20 g、赤小豆20 g、旱蓮草20 g、覆盆子10 g、生甘草10 g。大鼠腎草酸鈣結(jié)石造模方法參照相關(guān)文獻[7-8]嚴格實施；對照組大鼠予以標準飲食，自由飲水；其余兩組標準飲食，1%乙二醇自由飲水，每日清晨采用2%氯化銨灌胃，每只2 mL，連續(xù)實施4周。給藥劑量參考《藥理實驗方法學》[9]：成年人體質(zhì)量按照60 kg計算，成年人滋腎排石湯日用量為生藥60 g，大鼠系數(shù)0.018/200 g[10-11]，因而滋腎排石湯組=60×0.018/200=5.4 g/kg。按照以上劑量于每日下午進行灌胃，每100 g灌胃2 mL，連續(xù)實施4周，同時結(jié)石組大鼠灌胃等量的生理鹽水。

1.3 觀察指標

1.3.1 尿液pH、尿鈣、尿草酸水平測定 于實驗4周末次給藥完成后，利用代謝籠采集大鼠24 h尿液，檢測尿液pH值，測定完成后以3 000 rpm速度離心5 min，離心，取上清液，于-80 ℃條件下凍存待檢。尿鈣含量與草酸濃度分別采用全自動生化分析儀及離子色譜儀測定。

1.3.2 腎組織草酸鈣晶體形成情況 之后稱大鼠體重，將大鼠以3 mL/kg的劑量用10%水合氯醛麻醉，取腎組織，稱重。各組中隨機取12只進行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)，石蠟切片，放大100倍觀察腎組織中草酸鈣晶體形成情況。腎組織中草酸鈣晶體分級標準[12-14]：(1)0級：未發(fā)現(xiàn)結(jié)晶亮點；(2)Ⅰ級：存在許多細小結(jié)晶亮點，但未成堆；(3)Ⅱ級：存在粗大、成堆的結(jié)晶，但未互相連接；(4)Ⅲ級：成堆的結(jié)晶局部互相連接；(5)Ⅳ級：許多成堆的結(jié)晶并連接成片。

1.3.3 腎組織SOD、MDA測定 各組剩余12只左腎制成10%勻漿，在4 ℃下以5 000 rpm離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法嚴格按照試劑盒說明書測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.4 腎組織TGF-β、OPN測定 各組剩余12只右腎組織切片，采用免疫組織化學法進行炎性相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和骨橋蛋白(OPN)的測定。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組間雙腎成石程度對比

Pearson χ2檢驗結(jié)果顯示，各組間雙腎成石率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雙腎成石率由高到低依次為結(jié)石組(100.00%)>滋腎排石湯組(29.17%)>對照組(0.00%)(P<0.05)。見表1。

表1 各組間雙腎成石程度對比[n(%)]

2.2 各組大鼠尿pH的比較

Mann-Whitney U檢驗結(jié)果顯示：各組大鼠的尿pH比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；該結(jié)果提示滋腎排石湯療效可能與尿pH無明顯相關(guān)關(guān)系。見表2。

表2 各組大鼠之間尿pH、尿鈣與尿草酸水平比較

2.3 各組大鼠尿鈣與尿草酸水平比較

Mann-Whitney U檢驗結(jié)果顯示，滋腎排石湯組尿鈣與尿草酸水平均低于結(jié)石組(P<0.05)；滋腎排石湯組尿鈣及尿草酸水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠尿鈣與尿草酸水平比較

2.4 各組大鼠腎臟組織中SOD及MDA含量比較

與對照組相比，結(jié)石組大鼠腎臟組織中MDA含量顯著增加(P<0.05)，SOD含量顯著降低(P<0.05)；與結(jié)石組相比，滋腎排石湯組大鼠腎臟組織中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腎臟組織中SOD及MDA含量比較

2.5 各組大鼠腎臟組織中TGF-β和OPN比較

與對照組相比，結(jié)石組大鼠腎臟組織中TGF-β和OPN陽性率顯著增加(P<0.05)；與結(jié)石組相比，滋腎排石湯組大鼠腎臟組織中TGF-β和OPN陽性率顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎臟組織中TGF-β和OPN比較[n(%)]

3 討論

近年來，隨著飲食習慣、生活方式的轉(zhuǎn)變，泌尿系結(jié)石的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢[15]。本研究建立了大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，并采用消食湯進行灌胃治療結(jié)果顯示，各組間雙腎成石率差異有統(tǒng)計學意義；雙腎成石率由高到低依次為結(jié)石組>滋腎排石湯組>對照組；該結(jié)果提示滋腎排石湯對大鼠腎草酸鈣結(jié)石具有一定的防治作用。多年臨床實踐證明，滋腎排石湯能有效降低患者尿中草酸含量，預防結(jié)石生成和復發(fā)[16-17]，與本研究結(jié)果基本一致。

草酸鈣結(jié)石形成及復發(fā)的主要責之于脾，并可累及腎與心，其治療的關(guān)鍵為通利三焦[18]。多數(shù)草酸鈣結(jié)石患者伴有脾陽、脾氣不足，有些患者心火過盛下移膀胱與小腸，引發(fā)膀胱濕熱，對小腸的分清泌濁功能產(chǎn)生不良影響。滋腎排石湯組方組方之中焦山梔為君藥，味苦性寒，具有清熱利濕、瀉火除煩的作用，能入肺、心、三焦經(jīng)[19]；赤茯苓能泄心、小腸及膀胱濕熱、利竅行水之效；赤小豆具有行血補血、利水消腫、健脾去濕之效，可瀉心經(jīng)之火；覆盆子具有溫腎，濃縮尿液的功效，雞內(nèi)金化石溶石；多藥合用可有效降低尿草酸含量，滋腎排石。

本研究對各組大鼠之間尿pH、尿鈣與尿草酸水平進行對比分析。滋腎排石湯療效與尿pH無明顯相關(guān)關(guān)系。而尿鈣與尿草酸水平高是誘發(fā)泌尿系草酸鈣結(jié)石的主要因素。尿鈣水平高易引發(fā)草酸鈣的過飽和進而導致泌尿系結(jié)石形成[19]。本研究顯示，滋腎排石湯組尿鈣水平低于結(jié)石組，且與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示滋腎排石湯組可降低尿鈣水平。尿草酸水平較高對腎細胞有明顯的毒副作用，當腎上皮細胞暴露于草酸中時，會影響腎上皮細胞的活性，較高的草酸水平還會導致細胞線粒體功能發(fā)生變化，導致上皮細胞壞死，促進結(jié)晶的黏附、核化以及生長[20]。本研究顯示滋腎排石湯組尿草酸水平均低于結(jié)石組，提示滋腎排石湯組能有效降低患者尿中草酸含量。本研究還顯示，與對照組相比，結(jié)石組大鼠腎臟組織中MDA含量顯著增加，SOD含量顯著降低，TGF-β和OPN陽性率顯著增加；與結(jié)石組相比，滋腎排石湯組大鼠腎臟組織中MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，TGF-β和OPN陽性率顯著降低。該結(jié)果提示氧化應激和炎性反應可能在草酸鈣結(jié)石的形成中具有重要作用，滋腎排石湯組雙腎成石率、尿鈣與尿草酸水平均較低，而其氧化應激和炎性反應也較輕，提示滋腎排石湯組可能通過改善氧化應激和炎性反應發(fā)揮保護腎功能的作用。

綜上所述，滋腎排石湯可能通過改善氧化應激和炎性反應以顯著降低尿鈣與尿草酸的含量及雙腎的成石率。