尿蛋白組學現代化檢測技術及其在運動中的應用

楊 玲, 林文弢

(1.韶關學院,廣東 韶關 512005; 2.珠?？萍紝W院,廣東 珠海 519041)

尿蛋白組學是一門快速興起的新學科,也是當今運動生物化學研究的新領域,尿蛋白組學研究已成為運動訓練的一個新熱點[1]。開展尿蛋白組學研究,探索蛋白組學的現代化測試與評價方法,有助于我們更好地理解運動訓練的原理,尋找過度疲勞早期診斷的特異性生物學標志、運動訓練的科學監(jiān)控手段與運動能力的評價方法,保障優(yōu)秀運動員身體健康,提高其運動能力。本文通過分析運動性尿蛋白的測試與評價方法,介紹尿蛋白組學的最新檢測技術與應用,為科學的運動訓練提供依據。

1 運動員尿蛋白測試與分析

運動員尿液中含有大量物質代謝的終產物和其他物質,這些物質反映運動員體內的基本情況,包括身體機能狀況、對運動訓練的適應程度,也可評定運動員的運動能力[2]。因此,科學測定和分析尿液成分非常重要。然而,尿液成分測試的影響因素較多,測試結果受檢測儀器和方法的限制,如最早的尿蛋白測試僅僅是定性分析和半定量分析。隨著科技的發(fā)展,尿蛋白檢測技術越來越先進,分辨率越來越高,測試結果也從一種尿液總蛋白到目前的近萬種尿蛋白類型。利用現代化尿蛋白檢測技術與方法,能更科學地評定運動員的運動能力。

1.1 尿蛋白定性檢測

磺基水楊酸法、試紙法、醋酸加熱法和考馬斯亮藍法是尿蛋白定性檢測的常用方法(表1)。在正常情況下,尿蛋白定性測試呈陰性,但容易受到一些因素干擾,致使結果呈假陽性。如：尿酸鹽含量高時,尿呈酸性反應,蛋白試紙法結果較實際情況低;如果運動員大量使用青霉素,磺基水楊酸法易呈假陽性反應;當尿呈強堿性時,尿蛋白定性檢測假性結果更多。因此,進行尿蛋白定性檢測時,應綜合各種因素選擇最適宜的方法,若有條件最好進行定量檢查。

表1 尿蛋白定性檢測常用方法

1.2 尿蛋白定量檢測

24 h尿蛋白排出量、單次尿單位體積中蛋白質含量、尿蛋白與肌酐的比值是尿蛋白定量檢測常用的3種表達方式。單次尿單位體積中蛋白質檢測方法簡單,但受尿濃縮和稀釋的影響,準確性差;24 h尿蛋白排出量雖然不受尿比重影響,但留取24 h尿液的準確性直接影響檢測結果,尿中蛋白質的排出率也受受試者運動強度和用藥等因素的影響[3];運動訓練中常用尿蛋白與肌酐的比值反映運動負荷對機體的影響。

2 尿蛋白組學測試技術

尿蛋白組學概念的提出為高通量、高效、準確、靈敏地從整體角度研究運動與尿液蛋白質組分的關系提供了較好的平臺。目前尿蛋白質組學研究常用的分析技術[4]如表2所示。其中,雙向凝膠電泳(2-DE)和質譜(MS)聯用分析是最常見的技術方法。不同技術各有其優(yōu)勢和局限,近年來,串聯質譜分析方法的應用大大提高了檢測結果的可靠性。

表2 不同蛋白質組學分析技術比較

2.1 雙向凝膠電泳(2-DE)技術

2-DE技術是根據蛋白質等電點不同在pH值梯度膠中等電聚集將其分離,然后按照分子量大小在垂直或水平方向進行凝膠電泳(SDS-PAGE)第2次分離。由于pH值梯度不穩(wěn)定,重復性差,對細胞內的低拷貝小蛋白、極端酸性蛋白或堿性蛋白、分子量過大或過小蛋白、難溶蛋白(包括膜蛋白)等的電泳分離和檢測較難實現。2-DE一般只能分辨1 000～3 000個蛋白質點。

2.2 相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)技術

iTRAQ技術將同位素標記法與串聯質譜技術相結合,能夠高通量地尋找不同蛋白質組的差異蛋白并準確進行相對或絕對定量,可檢測到的蛋白包括胞漿蛋白、線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白。同時,也能對不同類型的蛋白質進行鑒定,包括高分子量,酸性、堿性蛋白質等,但它一次最多只能上機10個樣本,通量相對受限。

2.3 數據非依賴性采集(DIA)技術

DIA技術融合了傳統(tǒng)蛋白質組學“鳥槍法”和質譜絕對定量“金標準”,通過液相色譜和質譜聯用技術(LC-MS/MS)對樣本進行全范圍掃描,從若干個窗口高速、循環(huán)地對質譜中特定質量范圍內的所有母離子進行碎裂、檢測,從而無遺漏、無差異地采集所有母離子的碎片離子信息進行蛋白定性和定量分析,實現蛋白質的深度覆蓋和精準定量。

3 尿蛋白組學技術在運動訓練中的應用

運動訓練可引起機體內環(huán)境、離子濃度、代謝物、營養(yǎng)狀態(tài)等發(fā)生一系列改變,進而影響相關基因表達和蛋白質合成,也會使運動前后蛋白質組圖譜出現差異。不同水平運動員對運動訓練的應答性反應不同,蛋白質圖譜表達也有所差異。

3.1 評定不同運動負荷

運動引起的正常人尿液中蛋白質含量增多但在數小時后消失,稱為運動性蛋白尿。運動性蛋白尿排出的數量和成分可作為評定運動員身體機能狀態(tài)、負荷強度和負荷量的指標。

3.2 運動性疲勞標志物

有訓練就有疲勞,適度疲勞可以刺激機體超代償恢復,提高運動能力,過度運動疲勞會損害身體健康,嚴重影響運動能力。通過尿蛋白組分變化檢測與分析,可尋找運動性疲勞的生物標志物。

對比不同強度跑臺運動前后尿蛋白組分的變化,發(fā)現載脂蛋白A1和鋅α2-糖蛋白與能量代謝相關,在降低體重、減少脂肪含量及調控能量代謝方面有重要作用。研究[9]發(fā)現,劇烈運動后尿液中的鋅α2-糖蛋白排出量增加了20倍,可能是因為高強度、長時間運動引起機體乳酸堆積,疲勞加深,為了滿足運動時能量的需求,引起鋅α2-糖蛋白合成率增加,促進脂肪分解,加強能量供應。應用雙向電泳質譜技術在長距離耐力運動后尿液中也檢測出鋅α2-糖蛋白。這提示鋅α2-糖蛋白可能與運動疲勞有關,其是否能作為運動疲勞的監(jiān)測蛋白還需深入研究?？梢?尿蛋白組學的檢測和分析可以更好地監(jiān)控運動訓練。

3.3 運動員體能生化評定

不同運動的應激程度造成身體機能狀態(tài)不同,產生的尿蛋白組分改變也存在差異[10]。一次大運動量訓練后,尿蛋白少,表明機能狀態(tài)較好;尿蛋白排出量增多,但4 h后或次日晨完全恢復到安靜時水平,表明機體適應此負荷;如果次日晨尿蛋白仍不減少或增加,表明運動負荷太大,機體不適應,要適當減少運動量和強度。運動后尿蛋白恢復快,表明運動員恢復狀態(tài)較好。在一個訓練周期中,可以用尿蛋白作為監(jiān)測指標,觀察運動員對訓練負荷的適應情況。在大運動量訓練過程中,訓練開始階段身體不適應時,尿蛋白排泄量增多;繼續(xù)一段訓練后,完成相同強度的練習時,尿蛋白又會減少,這是身體適應運動量的表現。如果尿蛋白不減少或增加時,就需注意運動員的身體狀態(tài),減少訓練強度或訓練量。

綜上所述,尿蛋白組學技術能夠比較全面、綜合地分析運動對機體的影響,打破以往僅研究幾個蛋白質的局限,為揭示機體適應運動刺激的變化機制提供了新的視野和研究動向,為運動訓練的監(jiān)控提供了更好的平臺,如圖1所示。

圖1 尿蛋白組學方法及應用示意

4 尿蛋白組學技術在運動訓練中的展望

目前,尿蛋白組學技術在醫(yī)學和體育學的研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息技術對蛋白組學的各種數據進行處理和解析,也可對已知或新的基因產物進行全面分析,從而科學鑒定、分析蛋白質在不同條件下的表達水平,尋找疾病早期診斷的特異性生物學標志。因此,蛋白組學的鑒定與分析在臨床早期診斷、療效判斷、病程監(jiān)測、藥物靶點開發(fā)、運動負荷評定、運動性疲勞檢測等方面有重要意義和廣闊前景。

我國科學家對健康人尿蛋白質組的生理波動性和個體間差異進行了系統(tǒng)評估,在此基礎上建立了世界上首個蛋白質組規(guī)模的健康人尿蛋白定量參考范圍。健康人尿蛋白定量參考范圍在健康監(jiān)測、腫瘤篩查及過度疲勞研究等方面具有重要的應用價值,從染色質的結構和功能、遺傳信息及組蛋白密碼動態(tài)變化對基因功能的調節(jié)機制等方面深入了解疾病的發(fā)生機理、靶向性藥物開發(fā)乃至個體化治療等,也為深入了解運動疲勞、提高運動能力開辟了新的方向。

5 小 結

近幾年,我國對尿蛋白組學技術在運動中的應用進行了較為詳細的研究,但均停留在運動后的變化研究上,對不同項目運動后尿蛋白組學的圖譜研究、過度運動疲勞的尿蛋白標志物篩選及尿蛋白評定運動能力等相關研究尚少。隨著運動科學的進一步發(fā)展,尿蛋白檢查技術的先進化與普及化,其一定會發(fā)揮更大的作用。