豬繁殖與呼吸綜合征病毒17-ZJ-HZ毒株的分離鑒定與分子流行病學分析

巴少波，石 林，李群景，劉正奎，陳 琳，王曉杜，宋厚輝

(浙江農林大學 動物科技學院，浙江 杭州 311300)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又名藍耳病，其病原體為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[1]。不同年齡、品種和性別的豬只均可感染PRRS，其臨床特征為母豬流產、死胎、弱胎、木乃伊胎及各年齡階段豬呼吸困難、敗血癥、發(fā)育遲緩和高死亡率等[2]。PRRSV基因組長度為15 kb左右，具有5′和3′非編碼區(qū)，有9個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，自5′到3′端依次為ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF7。PRRSV的基因型主要分為歐洲型和美洲型，2個基因型的同源性在60%左右[3-4]。在PRRSV中，ORF1a和ORF1b基因編碼非結構蛋白(non-structural protein，NSP)，參與病毒基因組轉錄、復制；ORF2-ORF7編碼病毒的結構蛋白，依次編碼囊膜蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、膜基質蛋白M和核衣殼蛋白N[5-7]。目前，全國各豬場一直都有PRRSV流行，最主要原因是其病毒變異大和疫苗不能有效防控該病，核苷酸變異存在于整個病毒基因組中，尤其以NSP2基因變異最大，不同基因型的毒株NSP2核苷酸序列同源性僅為40%左右，同型的毒株之間NSP2核苷酸序列同源性80%左右，因此大多數(shù)科學家認為NSP2為PRRSV變異的主要遺傳標記[8-9]。盡管有研究表明，NSP2基因的1+29個氨基酸缺失與HP-PRRSV的高致病性無直接相關，但NSP2的該缺失仍然認為是HP-PRRSV的標志[10]，而NSP2基因高頻率變異的潛在意義更加值得關注[11]。GP5作為PRRSV的主要抗原糖蛋白 ，其氨基酸在美洲型和歐洲型之間僅有51%～55%的同源性。GP5蛋白含有6個抗原決定簇，其中決定簇B是最主要的中和抗原表位，可以誘導中和抗體，因此GP5常作為PRRSV的疫苗設計的候選對象，用于開發(fā)新型疫苗[12-13]。目前控制PRRSV疫情疫苗有弱毒苗和滅活苗兩種，雖然大規(guī)模發(fā)病有所控制，但是PRRSV的地方性流行和散發(fā)所帶來的危害仍不容忽視，中等致病性PRRSV(NADC30)已成為國內的主要流行毒株[14-15]。隨著免疫壓力和豬群持續(xù)帶毒，PRRSV基因組還在持續(xù)變異，因此定期對PRRSV流行情況進行監(jiān)測，將為養(yǎng)殖場針對性的免疫預防措施提供科學依據(jù)，也有利于預測PRRSV將來發(fā)病的趨勢。近期浙江省某豬場保育豬群出現(xiàn)高熱、呼吸困難和死亡等臨床癥狀；本研究對該場送檢病死豬的病料樣本，開展了病原學檢測、病毒分離和鑒定，確診該病為高致病性的PRRSV引起；通過觀察攻毒豬只的臨床表現(xiàn)，確定該毒株屬于高毒力毒株；同時本研究調查了近幾年華東地區(qū)PRRSV的分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 細胞、病料樣品及豬只來源

MARC-145細胞由本實驗室保存，病料樣品采集自浙江省杭州市某發(fā)病豬場，初生仔豬購于臨安某豬場。

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及KOD-PCR試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司(TOYOBO)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(中國株)實時熒光定量PCR檢測試劑盒來自浙江多亞隆醫(yī)藥科技有限公司，RNA提取試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術有限公司(TAKABA)，PRRSV特異性N抗體由浙江大學動物預防醫(yī)學所實驗室惠贈。HRP標記羊抗小鼠IgG抗體購自于BBI公司，F(xiàn)ITC標記羊抗小鼠IgG抗體購自Invitrogen公司。

1.3 樣品核酸提取及RT-PCR檢測

用Trizol法提取病毒核酸，依據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(中國株)實時熒光定量PCR檢測試劑盒方法，進行一步法熒光定量RT-PCR檢測。

1.4 病毒的分離

PRRSV陽性的肺臟組織經(jīng)研磨后，12 000 r·min-1離心5 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，取500 μL過濾液感染單層MARC-145細胞，37 ℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后棄去上清，加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后觀察細胞病變(cytopathic effect，CPE)。出現(xiàn)80%CPE時，收取上清病毒液，同時收集細胞沉淀，病毒上清液按照前述方法傳代至P4代，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Western-blot病毒的鑒定

取PRRSV P4代病毒感染MARC-145細胞48 h，收集細胞沉淀，加入細胞裂解液(1% NP40)充分裂解細胞沉淀，超聲波進行超聲，獲取細胞總蛋白液。以PRRSV N蛋白的特異性單抗為一抗，進行Western-blot 驗證，β-actin作為內參對照。

1.6 間接免疫熒光(IFA)病毒的鑒定

將PRRSV毒株P4代病毒感染MARC-145細胞，48 h后用4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5% Triton X-100打孔20 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，PRRSV N蛋白特異性單抗(1∶400)孵育1 h，TBST洗滌3次，每次3 min，F(xiàn)ITC標簽的goat-anti-mouse的二抗(1∶500)孵育45 min，TBST洗滌5次，每次3 min，DAPI對細胞核染色5 min，熒光顯微鏡觀察結果。

1.7 PRRSV全基因組序列擴增

按照反轉錄試劑盒說明書，進行反轉錄合成CDNA，根據(jù)NCBI上已知PRRSV全長進行分段設計引物，一共5段分別為1-3228、3228-5002、5002-8798、8798-12071、12071-15327。然后以如下PCR體系及反應條件進行分段擴增。體系分配如下：31 μL的滅菌ddH2O，5 μL 10×KOD buffer、5 μL dNTPs、3 μL MgSO4、1 μL KOD Plus Neo、引物1.5 μL、2 μL cDNA，反應條件為94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個循環(huán)；68 ℃ 7 min。PCR擴增的5段序列分別命名為788、790、792、794、796，PCR產物送生物公司進行測序。然后以測序成功的5段序列為模板，設計擴增5個片段連接處的引物，分別命名為788-790、790-792、792-794、794-796(表1)。

1.8 生物信息學分析

對序列結果用Vector NTI軟件進行拼接，獲得17-ZJ-HZ全基因組核苷酸序列，同時用VectorNTI軟件對病毒基因組進行核苷酸序列及其推導氨基酸序列的比對分析，用MEGA7軟件對病毒進行遺傳進化分析。

表1 RT-PCR全基因組擴增各種引物Table 1 The sets of primers for amplification of whole virus genome by RT-PCR

表2 PRRSV 毒株名稱及其來源Table 2 The strains and sources of PRRSV

JX12為本實驗室2012年分離株。
JX12 was isolated by our labrotary in 2012.

1.9 17-ZJ-HZ毒株致病性分析

將3日齡PRRSV抗體陰性的6只仔豬隨機分為兩組，第一組為攻毒組3頭，通過滴鼻的方式接種PRRSV 17-ZJ-HZ株，接種劑量為106TCID50·頭-1；第二組為對照組3頭，接種相同體積不含病毒的DMEM。攻毒后，每天觀察仔豬癥狀，當豬出現(xiàn)典型PRRSV臨床癥狀時，解剖各組仔豬，檢查各臟器病理變化，取肺臟正常和病變組織，以PRRSV的N蛋白單克隆抗體為檢測抗體，送生物公司進行免疫組化試驗。

2 結果與分析

2.1 臨床樣品的檢測

送檢的3個臨床樣品采用熒光定量RT-PCR進行檢測，結果表明3個陽性樣本的通道中有明顯的擴增曲線(圖1-A)，其Ct值分別為24.72、24.83、28.72，依據(jù)試劑盒判定標準(Ct值小于32則為陽性)，所以3個樣品均判定為陽性。

2.2 PRRSV的分離鑒定

選取其中一個肺臟組織樣品進行勻漿處理，0.22 μm濾膜過濾組織勻漿液，濾液接種單層MARC-145細胞。感染48 h后，顯微鏡下觀察細胞狀況，Mock組MARC-145細胞生長良好，而感染組細胞皺縮呈索狀、脫落、細胞核濃縮聚集在一起(圖1-B)。感染72 h后收集上清，作為種毒保存，連續(xù)傳3代，第4代時進行噬斑純化(結果未顯示)，純化分離的病毒命名為PRRSV 17-ZJ-HZ株。該病毒感染MARC-145，Western-blot檢測細胞沉淀中PRRSV-N蛋白的表達，結果表明病毒感染組有明顯的表達條帶(圖1-C)；間接免疫熒光檢測結果表明，病毒感染組有明顯綠色熒光信號，說明病毒的PRRSV-N蛋白得到表達(圖1-D)。以上多個實驗證明，本研究分離獲得一株PRRSV病毒，為開展后續(xù)研究奠定了基礎。

A， 臨床送檢樣品檢測；B， PRRSV感染MARC-145細胞病變觀察；C， Western-blot檢測PRRSV-N蛋白表達；D， 間接免疫熒光檢測PRRSV-N蛋白表達。A， Detection of clinic samples by RT-PCR; B， Cytopathic effect of PRRSV infected MARC-145 cells; C， Expression of PRRSV-N by Western-blot; D， Expression of PRRSV-N by IFA.

2.3 PRRSV分離株基因組全長片段擴增

提取PRRSV感染的MARC-145總RNA，反轉錄合成cDNA后，利用PRRSV全基因組擴增引物(表1)，進行分段擴增(圖2)，所獲得片段經(jīng)純化后送生物公司測序。由于PCR產物測序不能獲得全長片段，所以再以測序結果為模板設計引物(表1)，擴增相鄰兩段之間的序列，然后送生物公司進行測序。把兩次測序的結果進行拼接，獲得17-ZJ-HZ株全基因長度為15 325 bp，提交給GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank號為MF770574。

M，10 kb DNA分子量標準；1～6， 788、790、792、794、796擴增片段。M， 10 kb DNA marker；1-6， Amplified fragment of 788， 790， 792， 794， 796.

2.4 PRRSV分離株的生物信息學分析

利用生物信息學軟件(MegAlign)分析本毒株的Nsp2氨基酸序列，與其他25株PRRSV毒株(表2)序列比較，結果表明17-ZJ-HZ株與高致病性毒株HUB2、HUN4、TJ等的NSP2蛋白氨基酸序列的關鍵結構域幾乎一樣(圖3)，在482、533-561 aa位置存在1+29個氨基酸的缺失，指示17-ZJ-HZ為高致病性毒株，而且近幾年浙江及其周邊的福建、江西等地流行的15ZJ2、15ZJ3、FJXS15、JX12、15JX2、15JX3等毒株也存在該位點1+29個氨基酸的缺失(圖3)，說明華東地區(qū)高致病性毒株仍然存在一定的流行。同時，近幾年浙江及周邊地區(qū)還存在15ZJ1、15JX1、FJM4、FJ1406等缺失特征不同毒株的流行，這些毒株在330-441 aa位置存在111個氨基酸的缺失，533-561 aa存在不連續(xù)的20個氨基酸的缺失，這類毒株Nsp2的缺失特征與2008年美國分離的NADC30株相符，說明該地區(qū)存在NADC30-like毒株流行。

基于ORF1a、GP5氨基酸序列及病毒全基因組核苷酸序列分別繪制遺傳進化樹，進化分析表明，25個毒株分兩個基因型(歐洲型和北美型)，其中基因I型包含經(jīng)典毒株、高致病性毒株和NADC30-like毒株，17-ZJ-HZ毒株歸屬于高致病性PRRSV?；贠RF1a進化分析表明17-ZJ-HZ與15ZJ2、15ZJ3、FJXS15、JX12、15JX2、15JX3、HUB2、HUN4、TJ毒株在一個亞群(圖4-A)，但是獨立成為一個新的小分支，它們同屬于高致病性毒株，BJ4、CH2004、CH1a等聚在一個亞群，同屬于經(jīng)典毒株，GD3毒株的分子遺傳進化位于經(jīng)典毒株CH1a和HUB2、HUN4、TJ等強變異毒株之間，F(xiàn)J1406、FJM4、15ZJ1、15JX1等毒株聚在一個亞群，同屬于NADC30-like毒株?；贕P5氨基酸序列進化分析表明(圖4-B)，17-ZJ-HZ單獨一個小分支，與GD3相比，17-ZJ-HZ與HUB2、HUN4、TJ毒株親緣關系更遠一些，更靠近經(jīng)典毒株，強毒株FJXS15株則被分在NADC30-like簇中。全基因組核苷酸進化分析結果顯示，17-ZJ-HZ靠近GD3毒株，說明該毒株遺傳進化位于經(jīng)典毒株和強毒株之間。

2.5 17-ZJ-HZ毒株的致病性

豬群在感染初期無明顯臨床癥狀，攻毒36 h后，攻毒組豬群開始出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、體溫在39.5～41.0 ℃波動，呈現(xiàn)稽留熱等癥狀。當攻毒達60 h時，病豬開始表現(xiàn)為眼結膜炎、眼瞼水腫，劇烈喘氣、站立不穩(wěn)，呈俯臥狀態(tài)，腹部皮膚發(fā)紅、耳部發(fā)紺(圖5-A)，出現(xiàn)典型的HP-PRRSV癥狀。解剖發(fā)現(xiàn)，病豬的肺臟水腫、充血(圖5-B)。免疫組化試驗結果顯示，感染組肺泡輪廓消失，單核細胞浸潤，感染灶周邊有大量感染顆粒(棕黃色)，PRRSV的N蛋白高表達，出現(xiàn)PRRSV典型病灶(圖5-D)。

3 討論

自PRRS暴發(fā)以來，高致病性毒株給我國乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前臨床上主要靠預防的手段來防控該病，但仍然存在很多問題，主要原因是一方面沒有專門針對PRRS的藥物，另一方面疫苗的防控存在滅活苗抗體針對性不強、弱毒苗容易變異和毒力返強的問題。由于PRRSV毒株變異快，疫苗種類較多，雖然在預防PRRS的發(fā)生中發(fā)揮了一定的作用，但是野毒株仍然不斷出現(xiàn)，對豬場危害還繼續(xù)存在。不同毒株疫苗的交叉和普遍使用，極易造成PRRSV毒株的變異，特別是弱毒疫苗株會出現(xiàn)毒力返強，野毒株和疫苗株通常在豬群中共存，病毒在豬群中的重組產生新的PRRSV，因此PRRS防控難度非常大[16-17]。調查PRRSV的遺傳進化規(guī)律，有利于掌握PRRSV變異趨勢，為新型有效疫苗研發(fā)和防控奠定基礎。近十年，PRRSV在不斷地進行變異。2006年我國暴發(fā)了Nsp2蛋白的482、533-561 aa位存在的1+29 aa缺失的HP-PRRSV[18]；2008年美國分離了1株在NSP2蛋白的322-432、482和504-522 aa區(qū)域存在111、1、19個氨基酸缺失的新毒株NADC30[19]；2013—2014年PRRSV毒株流行調查分析中發(fā)現(xiàn)，我國也存在NADC30-like毒株的流行[20-21]，河南地區(qū)以高致病性PRRSV流行為主，同源性只有83%左右，差異明顯[22]；2013年在我國河南省某豬場，從疑似PRRSV癥狀的發(fā)病豬群病料中分離得到PRRSV毒株(HeNan-A10)，其在GP2蛋白的247-256 aa位存在10 aa的缺失[23]；2017年廣東報道一例新的重組病毒，由兩個低致病性的病毒重組，其致病性較強[24]。由此可見，PRRSV在自然條件下，不管是否免疫都還在不斷地進行變異，因此監(jiān)測PRRSV的流行和進化趨勢，對于科學預防和控制該病是非常重要的。

A、B、C分別為基于ORF1a、GP5氨基酸序列和PRRSV病毒全基因組核苷酸序列的遺傳進化分析。A， B， C showed the genetic evolution analysis based on amino acids of ORF1a， GP5 and nucleotide of PRRSV genome.

本研究所采集的臨床樣品來自浙江省某豬場中正在發(fā)生高熱、呼吸困難和死亡等臨床癥狀的保育豬群，該豬場一直使用經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗株進行預防接種，從未使用過HP-PRRSV弱毒疫苗。檢測結果卻顯示3份臨床樣品均呈現(xiàn)HP-PRRSV陽性，感染MARC-145細胞分離病毒時，觀察到24 h細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、裂解等典型PRRSV細胞病變，這說明該場存在高致病性毒株的流行，隨后實驗也證明所分離的PRRSV毒株與HP-PRRSV的分子遺傳特征一致；PRRSV接種3日齡仔豬，60 h后仔豬出現(xiàn)典型的PRRSV臨床癥狀，更進一步證實該毒株屬于PRRSV強毒株。浙江及周邊地區(qū)所報道的PRRSV病毒(15ZJ2、15ZJ3、FJXS15、JX12、15JX2、15JX3等毒株)分析表明，其遺傳特征與HP-PRRSV一致，說明華東地區(qū)一直都存在HP-PRRSV毒株的流行，同時該地區(qū)還存在NADC30-like(15ZJ1、15JX1、FJM4、FJ1406毒株)毒株流行。本實驗室前期分離JX12毒株遺傳距離更靠近典型的高致病性毒株(HUB2、HUN4、TJ等)，而本研究所分離的17-ZJ-HZ遺傳距離相對更靠近NADC30-like，以上結果表明，隨著豬群不斷長期免疫，PRRSV隨免疫壓力增強，流行毒株通過不斷變異，毒力發(fā)生多種多樣的變化，其詳細機制需要進一步深入研究。

A，PRRSV感染豬的典型癥狀；B，PRRSV感染肺臟病變；C，未感染PRRSV組的肺臟組織免疫組化；D，PRRSV感染組的肺臟組織免疫組化。A， Typical symptoms of PRRSV infection in piglets; B， Pulmonary lesions caused by PRRSV infection; C， Pulmonary tissues from uninfected PRRSV groups were immunohistochemically stained; D， Pulmonary tissues from infected PRRSV groups were immunohistochemically stained.