刃天青顯色法影響因素考察及相關(guān)改良方法

江 丹

(1.廣州立白企業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東廣州，510370；2.廣東省日用化學(xué)品可再生資源研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510170)

在新型冠狀病毒引發(fā)的全球疫情形勢下，家養(yǎng)寵物是否會(huì)感染病毒，是否會(huì)成為病毒的中間宿主，寵物的衛(wèi)生安全引發(fā)了輿論和民眾的廣泛關(guān)注。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)給出權(quán)威解答：目前沒有證據(jù)顯示犬貓等寵物會(huì)感染新型冠狀病毒[1]。但是，做好寵物居住環(huán)境和寵物用品的清潔消毒工作仍然十分必要。在新冠疫情形勢下，具有消毒除菌功效的寵物清潔護(hù)理產(chǎn)品是家養(yǎng)寵物消費(fèi)者十分看重的價(jià)值點(diǎn)。然而，如何讓家養(yǎng)寵物消費(fèi)者在選購消毒除菌寵物清潔產(chǎn)品時(shí)切實(shí)地感受到除菌功效是業(yè)界的痛點(diǎn)。目前的現(xiàn)狀是，消毒除菌寵物清潔產(chǎn)品提供專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)的功效檢測報(bào)告，家養(yǎng)寵物消費(fèi)者很難獲得直觀的使用感受，特別是在“直播經(jīng)濟(jì)”浪潮下，如何在直播中直觀展示寵物消毒產(chǎn)品的抗抑菌功效，成為了消費(fèi)者和業(yè)界的迫切需要。因此，本研究旨在開發(fā)一種可視化的、定性的抗抑菌效果評價(jià)方法。

刃天青是一種傳統(tǒng)的氧化還原染料，常用于微生物的生存和增殖情況評估?；罴?xì)胞的代謝反應(yīng)將藍(lán)色、弱熒光的刃天青還原為粉紅色、強(qiáng)熒光的試鹵靈，說明細(xì)菌生長增殖。如果還原反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生，試鹵靈將繼續(xù)被還原成無色的、無熒光的二氫試鹵靈[2]。刃天青被還原的化學(xué)變化及顏色變化見表1。因此，可通過檢測刃天青的還原物質(zhì)試鹵靈和二氫試鹵靈的熒光強(qiáng)度來反應(yīng)細(xì)菌數(shù)量[3]。目前已有研究通過刃天青顏色變化進(jìn)行細(xì)菌的半定量分析，如肉類變質(zhì)檢測[4]、口腔中變形鏈球菌的數(shù)量檢測[5]等。

表1 刃天青的化學(xué)變化及其相關(guān)的顏色變化

實(shí)驗(yàn)考察了細(xì)菌培養(yǎng)方式、稀釋液、細(xì)菌濃度等因素對刃天青顯色法的影響，以期建立一種快速、可靠、可視化的評價(jià)產(chǎn)品抗菌除菌功效的方法，以適用于消毒除菌寵物清潔產(chǎn)品的直播功效展示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑與儀器

市售寵物消毒液，可用于寵物生活環(huán)境及用品的消毒除菌。

刃天青（購自阿拉?。?；氯化鈉（購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；葡萄糖（購自廣東光華科技股份有限公司，分析純）；蛋白胨（購自O(shè)XOID）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自廣東環(huán)凱微生物科技公司）；D/E中和肉湯（購自DB公司）。

0.1 %刃天青溶液：取刃天青0.1 g，加蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min，避光保藏不超過1周。

生理鹽水：取氯化鈉8.5 g，加蒸餾水1000 mL，待完全溶解后，調(diào)pH至7.2～7.4，經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20 min后備用。

PBS（0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液）：稱取無水磷酸氫二鈉2.83 g，磷酸二氫鉀1.36 g，加蒸餾水1000 mL，待完全溶解后，調(diào)pH至7.2～7.4，經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20 min后備用。

儀器均為微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刃天青顯色反應(yīng)的影響因素研究（

1）菌種培養(yǎng)方式

分別取36℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面菌種和營養(yǎng)瓊脂平板菌種，用0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種，用濁度儀調(diào)節(jié)菌懸液至濃度一致，用活菌計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌濃度。各取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計(jì)時(shí)，觀察刃天青顏色變化。

（2）促進(jìn)劑

取36℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂平板菌種，分別用無菌水、生理鹽水、2%蛋白胨溶液和0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 mL/塊平板，分別將菌懸液調(diào)整至濃度約3×108CFU/mL，同時(shí)按平板活菌計(jì)數(shù)法測定菌懸液濃度。

各取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計(jì)時(shí)，觀察刃天青顏色變化。

（3）細(xì)菌濃度

取36℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂平板菌種，用0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 mL/塊平板，并稀釋菌懸液至107～109CFU/mL，同時(shí)按平板活菌計(jì)數(shù)法測定菌懸液濃度。

分別取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，各加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計(jì)時(shí)，觀察刃天青顏色變化。

1.2.2 改良的刃天青顯色法和傳統(tǒng)殺菌測試方法對比

（1）傳統(tǒng)殺菌測試方法

用0.25%葡萄糖溶液將市售寵物消毒液稀釋至1:150和1:400，參考QB/T 2738－2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價(jià)方法》開展抗菌測試。要求對照菌懸液濃度控制在2×108～9×108CFU/mL；中和劑選用D/E中和肉湯；作用時(shí)間為1 min和5 min。殺菌率＞90%表示有殺菌作用。

（2）改良的刃天青顯色法

取3 6℃培養(yǎng)1 8～2 4 h的金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂平板菌種，0.2 5%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 m L/塊平板，將菌懸液調(diào)整至濃度2.0×108～9×108CFU/mL。

用稀釋菌懸液將市售寵物消毒液稀釋至1:150和1:400，取各稀釋液5 mL至無菌試管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計(jì)時(shí)，觀察刃天青顏色變化。同時(shí)取5 mL菌液稀釋液，按上述步驟操作，作為陽性對照，編號(hào)為C。

2 結(jié)果與討論

2.1 刃天青顯色法的影響因素

2.1.1 培養(yǎng)方式

細(xì)菌培養(yǎng)方式的影響見表2。從表2可以看出，在細(xì)菌濃度一致的情況下，平板培養(yǎng)的菌懸液使得刃天青顏色變化明顯快于斜面菌種懸液。提高斜面菌種的濃度至平板菌種濃度的3倍，其顏色變化速度也較平板菌種慢5 min以上。想要快速改變?nèi)刑烨囝伾?，平板培養(yǎng)菌種的方式優(yōu)于斜面。

表2 細(xì)菌培養(yǎng)方式的影響

2.1.2 促進(jìn)劑

促進(jìn)劑的影響見表3。從表3可以看出，2%的蛋白胨和0.25%葡萄糖均可以加速刃天青顏色的變化，有助于在短時(shí)間內(nèi)展示殺菌效果，0.25%葡萄糖的促進(jìn)效果優(yōu)于蛋白胨，以蛋白胨作為促進(jìn)劑的刃天青溶液在10 min時(shí)可變?yōu)榉奂t色，葡萄糖則可在5 min內(nèi)使得刃天青從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色。因此，選用0.25%葡萄糖作為刃天青顯色實(shí)驗(yàn)的促進(jìn)劑。

表3 促進(jìn)劑的影響

2.1.3 細(xì)菌濃度

細(xì)菌濃度的影響見表4。從表4可以看出，隨著細(xì)菌濃度的提高，刃天青顏色變化加快，細(xì)菌濃度接近時(shí)，刃天青顏色變化也較為接近。隨著孵育時(shí)間的延長，刃天青也逐漸從藍(lán)紫色向粉紅色轉(zhuǎn)變。在細(xì)菌濃度接近的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好。因此，觀察刃天青的顏色可以半定量地評估金黃色葡萄球菌的濃度。

表4 細(xì)菌濃度的影響

當(dāng)金黃色葡萄球菌的濃度為7.6×107CFU/mL時(shí)，需要9 min才能將刃天青轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。為了在5 min內(nèi)將刃天青的顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榉凵蚣t色，金黃色葡萄球菌的濃度應(yīng)在1.9×108CFU/mL以上；當(dāng)濃度在9.1×108CFU/mL及以上時(shí)，紅色/粉紅色的試鹵靈會(huì)在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步還原為無色的二氫試鹵靈。為保障刃天青顏色變化的時(shí)間波動(dòng)較小，細(xì)菌濃度調(diào)控范圍為2.0×108～9×108CFU/mL。

2.1.4 改良的刃天青顯色法

綜上，刃天青顯色反應(yīng)受到培養(yǎng)方式、促進(jìn)劑、細(xì)菌濃度等多種因素影響。為使顯色反應(yīng)發(fā)生在5 min之內(nèi)，改良的刃天青顯色法需具備以下條件：菌種為營養(yǎng)瓊脂平板新鮮培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，菌懸液用量為5 mL，0.1%刃天青溶液用量為100 μL，0.25%葡萄糖溶液作為促進(jìn)劑，菌懸液稀釋液濃度為2.0×108～9×108CFU/mL。

2.2 改良刃天青顯色法和傳統(tǒng)殺菌方法對比

2.2.1 傳統(tǒng)殺菌測試方法

為匹配刃天青顏色變化所需的細(xì)菌濃度，殺菌測試中初始加入細(xì)菌濃度也需達(dá)到108CFU/mL。殺菌作用時(shí)間為1 min時(shí)，寵物消毒液1:150稀釋液和1:400稀釋液均無殺菌作用，作用時(shí)間延長至5 min時(shí)，1:150稀釋液有殺菌作用（見表5）。

表5 傳統(tǒng)殺菌測試結(jié)果

2.2.2 改良刃天青顯色方法的測試結(jié)果

從圖1可以看出，稀釋150倍的寵物消毒液，孵育5 min顏色沒有變化，孵育18 h后，顏色略有變化，刃天青呈現(xiàn)藍(lán)紫色；而稀釋400倍的寵物消毒液，孵育4 min后，刃天青的顏色已經(jīng)從藍(lán)色變?yōu)樽霞t色，到第5 min時(shí)呈明顯的粉紅色。而陽性對照從4 min到5 min時(shí)，已經(jīng)從粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榻咏鼰o色。從孵育5 min至18 h，稀釋400倍的寵物消毒液和陽性對照顏色均沒有明顯變化。說明孵育5 min足以展現(xiàn)寵物消毒液的殺菌效果。

圖1 刃天青顯色法的測試結(jié)果

因此，稀釋150倍的寵物消毒液具有殺菌作用，稀釋400倍的寵物消毒液無殺菌作用。這與表4測試結(jié)果一致。由此說明，刃天青顏色變化法可用于寵物消毒液殺菌效果演示。改良的顯色反應(yīng)的結(jié)果和傳統(tǒng)殺菌測試方法的結(jié)果一致。上述顯色反應(yīng)耗時(shí)較短，在5 min之內(nèi)。而且結(jié)果可靠，適合用于即時(shí)殺菌效果評估。可以應(yīng)用于消毒除菌產(chǎn)品的直播功效展示。

3 結(jié)論

通過對刃天青顏色變化影響因素的研究，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌作為測試菌種時(shí)，菌種培養(yǎng)方式、促進(jìn)劑及菌懸液的濃度均對刃天青顯色反應(yīng)有明顯的影響。改良的刃天青顯色法包含以下的條件：選擇用營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)菌種，稀釋液為0.25%葡萄糖溶液，控制細(xì)菌濃度在2.0×108～9×108CFU/mL，該法可在5 min內(nèi)定性評價(jià)寵物消毒液的殺菌效果。