一株泛耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體的分離及其對(duì)細(xì)菌耐藥性變化的影響*

胡 嵐，王 鶴，王 超，齊文杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院感染內(nèi)科 100050)

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。噬菌體作為一種可以殺滅細(xì)菌的病毒，有著抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，由于它的生物學(xué)特性，對(duì)于臨床推廣和應(yīng)用也有很大的局限。深入的了解噬菌體的特性，以及它在吞噬細(xì)菌后對(duì)于細(xì)菌可能產(chǎn)生的影響，對(duì)于將來(lái)發(fā)展噬菌體療法以應(yīng)對(duì)泛耐藥細(xì)菌的危害有著一定的意義和價(jià)值。本研究探討一株泛耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體的分離及其對(duì)細(xì)菌耐藥性變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本院細(xì)菌室保存的一株泛耐藥肺炎克雷伯菌菌株。液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨(英國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)10 g，酵母提取物(英國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)5 g，NaCl 10 g，加去離子水(或蒸餾水)至1 L，pH 7.4；0.7%半固體 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉(美國(guó)Sigma公司)7 g，加去離子水(或蒸餾水)至 1 L，pH 7.4；1.5%固體 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，加去離子水(或蒸餾水)至 1 L，pH 7.4。將上述培養(yǎng)基配置完畢后送消毒供應(yīng)室高壓滅菌。SM液：100 mmol/L NaCl，100 mmol/L MgSO4，50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(美國(guó)Amresco公司)，pH 7.5，送消毒供應(yīng)室高壓滅菌。CaCl2，氯仿，聚乙二醇PEG8000(美國(guó)Sigma公司)。0.45 μm、0.22 μm生物濾膜(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1菌株的制備

一株泛耐藥肺炎克雷伯菌菌株通過(guò)血培養(yǎng)基培養(yǎng)方式進(jìn)行保留、傳代。無(wú)菌條件下劃線法接種在固體LB平板上，經(jīng)過(guò)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑選獨(dú)立菌落接種于10 mL的液體LB培養(yǎng)液(或肉湯培養(yǎng)液)中，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，本研究所用菌均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期致病菌。

1.2.2污水標(biāo)本制備

本院污水處理指定站點(diǎn)留取未經(jīng)處理前的污水3L(2～3次)。加入固體CaCl2至CaCl2的終末濃度為1 mmol/L，10 000 r/min離心20 min，取上清液加入PEG8000至終濃度為10.0%(W/V)，4 ℃冰箱過(guò)夜，12 000 r/min離心20 min，沉淀用5 mL噬菌體稀釋液重懸，加入等體積的氯仿，振蕩搖勻30 s，5 000 r/min離心20 min，取上清液先后用0.45 μm、0.22 μm濾膜過(guò)濾掉細(xì)菌及雜質(zhì)，僅留取小于0.22 μm物質(zhì)包括噬菌體[或?qū)U水14 170×g離心15 min，取上清液通過(guò)0.22 μm濾膜濾過(guò)細(xì)菌，將上清液加入等體積的含有肺炎克雷伯菌的LB培養(yǎng)液中，37 ℃過(guò)夜至少12 h，用以擴(kuò)增噬菌體，次日將培養(yǎng)液加入氯仿(32 μL/mL)萃取，4 ℃ 14 170×g離心15 min]。

1.2.3噬菌體分離

取上述制備完畢的污水100 μL，加入宿主菌(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎克雷伯菌LB液)液體200 μL，混勻后室溫放置15 min，加入47 ℃融化的0.7%瓊脂LB培養(yǎng)基2 mL，混勻后再傾倒于固體LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日觀察噬菌斑的出現(xiàn)情況。對(duì)有噬菌斑的，挑取單個(gè)噬菌斑，適當(dāng)稀釋后按上述方法再做噬菌斑形成實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次用以純化噬菌體。最后，挑取純化后的單個(gè)噬菌斑，接種于5 mL宿主菌中，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h以擴(kuò)增噬菌體，10 000 r/min離心20 min，收集上清液以0.22 μm濾膜過(guò)濾即得較純的噬菌體液。噬菌體提純，去除內(nèi)毒素，提純前后測(cè)定標(biāo)本中內(nèi)毒素水平。

1.2.4噬菌體滴度測(cè)定

將噬菌體液用液體LB培養(yǎng)基10倍連續(xù)稀釋，每稀釋度取100 μL，加入200 μL宿主菌液，然后按上述方法鋪雙層瓊脂平板。滴度(PFU/mL)=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，最終取10次結(jié)果的平均值為其液體滴度。

1.2.5細(xì)菌鑒定及耐藥性分析

制備噬菌體完畢后，將制備完畢的噬菌體回種到細(xì)菌培養(yǎng)基，證明其活性，觀察噬菌體溶液、細(xì)菌菌液、培養(yǎng)液共同培養(yǎng)后的變化，37 ℃過(guò)夜保存，當(dāng)出現(xiàn)由清涼再次變?yōu)闇啙岷?，將?xì)菌菌液在無(wú)菌條件下接種到固體LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑選獨(dú)立菌株送本院細(xì)菌室鑒定細(xì)菌及耐藥性分析，對(duì)比細(xì)菌耐藥性的變化情況。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌耐藥情況

本院一株肺炎克雷伯菌為泛耐藥菌株，噬菌體裂解刺激前藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 肺炎克雷伯菌的噬菌體刺激前后藥敏結(jié)果

2.2 噬菌體φKPN338HL7的分離

本實(shí)驗(yàn)篩選出一株能裂解泛耐藥肺炎克雷伯菌的噬菌體，根據(jù)國(guó)際命名規(guī)則將其命名為φKPN338HL7，經(jīng)過(guò)3次純化后，雙層LB平板可見(jiàn)清晰、等圓、大小均一、外緣光滑透明、直徑3～4 mm的噬菌斑，見(jiàn)圖1。

圖1 分離得到的噬菌體在雙層LB平板上形成的噬菌斑

2.3 φKPN338HL7滴度測(cè)定

根據(jù)不同濃度的噬菌體液與細(xì)菌混合后，培養(yǎng)所得的雙層平板結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)的噬菌體效價(jià)約為5×1010pfu/mL，見(jiàn)圖2。

2.4 φKPN338HL7溶原性測(cè)定

將1 mL懸液放入2 mL標(biāo)準(zhǔn)凍存管中，置于電動(dòng)攪拌器上，距離15 W紫外線燈管30 cm以外照射，并將照射后的噬菌體液與細(xì)菌液共同培養(yǎng)，并應(yīng)用單純細(xì)菌液做陰性對(duì)照、未照射噬菌體與細(xì)菌混合液做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示被照射滅活過(guò)的噬菌體無(wú)法再形成噬菌斑，與單純細(xì)菌液鋪板結(jié)果一致，因此，可以證明該噬菌體為裂解性噬菌體，非溶原性噬菌體。

2.5 φKPN338HL7最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定

本研究所得到的噬菌體以0.001、0.01、0.1、1、2、3、4、6、8的MOI進(jìn)行感染，結(jié)果顯示φKPN338HL7的MOI=4時(shí)所能產(chǎn)生最佳裂解效果，見(jiàn)圖3。

圖3 噬菌體感染復(fù)數(shù)結(jié)果

2.6 φKPN338HL7誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性變化

細(xì)菌在短暫培養(yǎng)液中傳代并不會(huì)改變細(xì)菌的耐藥性，而經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的噬菌體刺激后，該菌株對(duì)于亞胺培南及厄他培南的敏感性有所改變，其他種類的抗生素?zé)o明顯變化，見(jiàn)表1。

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)不斷地發(fā)展與進(jìn)步，人們對(duì)細(xì)菌的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，抗生素的發(fā)明和應(yīng)用為醫(yī)學(xué)帶來(lái)巨大的進(jìn)步。隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性也是不斷地提高，給公共衛(wèi)生帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)于泛耐藥的定義，目前國(guó)內(nèi)外基本可以達(dá)成一定的共識(shí)，認(rèn)為是對(duì)幾乎所有分類的常用抗菌藥物全部耐藥，僅對(duì)1～2種抗生素敏感時(shí)，稱為泛耐藥[1]。所以在這種情況下，臨床上很難應(yīng)用有效的藥物對(duì)患者進(jìn)行治療，目前迫切的需要尋找到新的抗生素或者新的治療方法來(lái)挽救這些患者的生命。

噬菌體治療細(xì)菌感染早已成為可能，有諸多體外實(shí)驗(yàn)提示噬菌體可以有效地對(duì)抗細(xì)菌，挽救生命[2-5]。噬菌體用于治療細(xì)菌感染有很多特點(diǎn)，首先噬菌體是一種病毒，它可以自我的復(fù)制、增殖，每一個(gè)裂解周期就可以釋放出更多的子代噬菌體，如果噬菌體裂解周期比細(xì)菌增殖速度快，那么1個(gè)噬菌體就可以消滅它所能識(shí)別的所有病原體。同時(shí)噬菌體又有非常嚴(yán)格的宿主專一性，僅能識(shí)別專一的某種或者某類病原體，這既是它的優(yōu)勢(shì)也是它的劣勢(shì)，優(yōu)勢(shì)是它不會(huì)對(duì)其他的細(xì)菌產(chǎn)生任何作用，這樣可以非常有效地保護(hù)好機(jī)體內(nèi)其他的細(xì)菌免受損傷，從而避免了廣譜抗生素常發(fā)生的細(xì)菌菌群紊亂，這種高度的專一性使得噬菌體可以進(jìn)行“靶向”治療[6]。但是這同時(shí)也帶來(lái)了問(wèn)題，有時(shí)候盡管是同種同屬的細(xì)菌，基因型稍有差異，那么噬菌體就有可能不能識(shí)別，而恰恰這一點(diǎn)也是限制了噬菌體發(fā)展的重要原因。已有很多關(guān)于利用噬菌體治療人類疾病的報(bào)道[7-8]，但宿主譜狹窄一直是治療中存在的問(wèn)題。正因?yàn)槿绱?，?guó)內(nèi)外才出現(xiàn)了許多“雞尾酒療法”的研究[9-10]，即將不同的噬菌體混合以提高宿主譜，從而達(dá)到有效的治療目的。

噬菌體制劑是目前比較前沿的制劑類型，國(guó)內(nèi)并沒(méi)有相應(yīng)的成品及藥品申報(bào)，美國(guó)亞瑟安德魯醫(yī)學(xué)公司(arthurandrew medical lnc.)研制生產(chǎn)的高活性復(fù)合噬菌體制劑Floraphge是全球首款復(fù)合制劑。另外，一種名叫分枝桿菌Actiphage噬菌體軟膏也被廣泛用于治療結(jié)核性口腔潰瘍。

上海的一些研究所也在采用噬菌體治療耐藥菌，但研究進(jìn)展緩慢。在國(guó)外主要以格魯吉亞等應(yīng)用最為廣泛，而俄羅斯、英國(guó)、美國(guó)等也有個(gè)案報(bào)告。

理論上只要噬菌體生長(zhǎng)的速度大于細(xì)菌的增殖速度就可能完成對(duì)容器內(nèi)所有細(xì)菌的殺滅,但實(shí)際上很難構(gòu)建一個(gè)數(shù)學(xué)模型來(lái)揭示噬菌體的代謝動(dòng)力學(xué)，TIWARI等[11]的研究表明，噬菌體發(fā)揮作用時(shí)要借助中性粒細(xì)胞，并在細(xì)菌體內(nèi)不斷繁殖裂解，同時(shí)超過(guò)72 h后噬菌體又會(huì)被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除，這種巧妙的平衡關(guān)系使得給藥時(shí)機(jī)與傳統(tǒng)抗生素有著本質(zhì)的區(qū)別，因此這種藥代動(dòng)力學(xué)研究起來(lái)是非常困難的。

本研究從醫(yī)院處理前污水中成功分離出一株能裂解泛耐藥肺炎克雷伯菌的噬菌體，并將其命名為φKPN338HL7。該噬菌體裂解的空斑清晰透明，這一點(diǎn)符合裂解性噬菌體的特點(diǎn)，其經(jīng)過(guò)紫外線誘導(dǎo)照射之后，再進(jìn)行噬菌斑實(shí)驗(yàn)時(shí)，并不能形成有效的噬菌斑，這表明紫外線照射對(duì)于噬菌體這類病毒可以起到滅活的作用，同時(shí)也證明此次分離得到的噬菌體是非溶原性噬菌體。因此可以通過(guò)這種紫外線誘導(dǎo)的方法得到鑒別溶原性與裂解性噬菌體的結(jié)論，溶原性噬菌體相對(duì)溫和，因此臨床上意義有限，而裂解性噬菌體其生物學(xué)特性比較猛烈，通常條件下可以快速裂解殺滅細(xì)菌，為臨床提供治療的可能，本實(shí)驗(yàn)所提取到的噬菌體就屬于此類。此前有研究已經(jīng)證實(shí)，除紫外線外，醫(yī)院常用的消毒劑對(duì)噬菌體的影響相對(duì)小[12]，其對(duì)噬菌體的影響率在50%以下，包括84消毒液、雙氧水、苯扎溴銨、石碳酸、戊二醛、碘伏等。噬菌體在某種層面上具有一定的穩(wěn)定性，這也為噬菌體將來(lái)可以在臨床廣泛應(yīng)用提供了一定的支持。

目前噬菌體的提取方法多種多樣，有應(yīng)用透析膜、冰水冷凝等。本研究發(fā)現(xiàn)，最簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方法也可以得到同樣的結(jié)果，同時(shí)本研究提供的方法簡(jiǎn)單，可操作性好，適合一些基層單位開(kāi)展。在噬菌體的保存方面，本研究與彭帆等[13]研究的結(jié)果類似，噬菌體的有效保存溫度在-20～4 ℃，而小于-20 ℃保存，則會(huì)在半年左右降低噬菌體的裂解活性，降低的速度則是多個(gè)指數(shù)等級(jí)的。

本研究也觀察到噬菌體與細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，可使渾濁的細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮后再次變?yōu)闇啙?，接種后不能再形成噬菌斑，提示細(xì)菌可能發(fā)生了基因的突變，使得表面的蛋白位點(diǎn)改變，噬菌體不能再對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，出現(xiàn)了“逃逸”的現(xiàn)象，這種情況屬于噬菌體對(duì)細(xì)菌外部環(huán)境的選擇結(jié)果，類似于抗生素的選擇，也是細(xì)菌強(qiáng)大的適應(yīng)性表現(xiàn)。但是本研究也顯示，誘導(dǎo)突變的細(xì)菌使某些抗生素敏感性發(fā)生一定的變化。這可能提示了細(xì)菌在發(fā)生基因突變的同時(shí)，某些耐藥基因也被改變，抑或丟失，使得原本無(wú)效的藥物可能再次有效，這需要對(duì)其進(jìn)行基因分析。在以后的研究中，有待進(jìn)一步的研究噬菌體是如何改變耐藥細(xì)菌的耐藥性，從而為治療泛耐藥細(xì)菌的感染提供一種有效的治療可能。