陸地棉類谷氧還蛋(GhGRL)基因家族生物信息學(xué)分析

馬爾合巴·艾司拜爾，成新琪，盧亞杰，李艷軍，劉 峰，秦江鴻，孫 杰*

(1.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆 石河子，832003; 2.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，新疆 石河子，832000)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)在植物不同器官各種代謝過程中產(chǎn)生[1]。植物正常的生長條件中，ROS 可以作為信號分子激活逆境響應(yīng)基因的表達，使逆境脅迫的植物做出相應(yīng)的逆境應(yīng)答反應(yīng)，以適應(yīng)環(huán)境變化[2-3]。但是，在遇到生物和非生物脅迫時，植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的速率迅速增加，導(dǎo)致ROS 的積累[4]。ROS 氧化蛋白質(zhì)巰基而生成二硫鍵(P-S-S-P)和谷胱甘肽的二硫鍵(P-S-S-G)，導(dǎo)致很多以巰基為催化中心的蛋白質(zhì)功能喪失，從而造成細胞凋亡[5-6]。植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，因此其濃度保持在一定范圍內(nèi)不會對植物體產(chǎn)生損傷。谷氧還蛋白(Glutaredoxin，Grx)屬于硫氧還蛋白超家族，廣泛分布在各種生物體內(nèi)。植物在逆境脅迫下體內(nèi)ROS增加時，谷氧還蛋白會處于氧化狀態(tài)從而導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS的功能活性降低。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的協(xié)助下可催化氧化狀態(tài)的蛋白質(zhì)二硫鍵或谷胱甘肽結(jié)合的二硫鍵還原為巰基，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)氧化還原的狀態(tài)從而調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)的活性，避免植物氧化性損傷[7-8]。目前已從擬南芥[9]、番茄[1]、水稻[10]、文心蘭“南茜”[11]等多種植物中分離到GRX基因，研究發(fā)現(xiàn)在植物抗逆和生長發(fā)育中GRX起著關(guān)鍵作用[12-13]。植物中的GRX根據(jù)其活性位點的保守殘基可分為CPYC-、CGFS-和CC-三個亞型[14-15]。CPYC型含有的活性位點是Cxx[C/S]，CGFS亞型的活性位點為CGFS，結(jié)構(gòu)與CPYC型相似。CC型GRX的活性位點為CC(M/L)(C/S)，主要存在于高等植物[10]。在對水稻和擬南芥 GRX 蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)具有 GRX 功能特性的GRL(GRX-like)蛋白，因此GRX基因拓展為 CPYC、CGFS、CC-type和 GRL四個類型[16]。從各類型GRX中，CC型和GRL型所占比例最多，推測GRL基因在進化過程具有重要作用。GRL基因成員與典型的GRX基因同源性低，其編碼蛋白質(zhì)大多數(shù)具有八個保守的半胱氨酸，排列在C末端的兩個CxxCx7CxxC簇中，但不涉及活性位點基序CxxC/S[17]。水稻的GRL型基因OsGRL2可以在抵抗砷脅迫的過程中發(fā)揮作用[18]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，GRL型谷氧還蛋白基因相對于其他類型基因更廣泛的參與非生物脅迫[19-20]。利用生物信息學(xué)方法對陸地棉GhGRL基因家族的進化關(guān)系、蛋白質(zhì)序列、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和染色體分布進行了分析，并對該家族基因的表達模式進行了研究，為進一步揭示GhGRL基因的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陸地棉類谷氧還蛋白家族基因的鑒定及理化特性分析

根據(jù)擬南芥GRL蛋白序列，從棉花數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org)和生物學(xué)數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)中檢索，獲得陸地棉中候選的GRL基因及蛋白序列(Gossypium hirsutum,NAU,Version 1.1)，通過NCBI Conserved Domain Search(CDD,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Instruct-re/cdd/wrpsb.cgi)平臺驗證其保守結(jié)構(gòu)域。染色體定位、相對分子質(zhì)量、等電點、編碼氨基酸長度等用在線軟件Expasy(http://web.expasy.org/protparam)計算。GhGRL家族成員的亞細胞定位預(yù)測利用在線軟件CELLO v2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)。

1.2 陸地棉類谷氧還蛋白家族基因進化樹和基因結(jié)構(gòu)圖構(gòu)建

使用 MEGA5.0進行進化樹分析，進化樹用鄰接法，1000次重復(fù)。GhGRL基因結(jié)構(gòu)圖用在線工具GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析和繪制。

1.3 陸地棉類谷氧還蛋白家族基因多重序列比對及保守基序分析

使用ClustalX和DNAMAN軟件對GhGRL氨基酸序列進行多重序列比對。GhGRL蛋白序列的保守基序利用在線軟件 MEME(http://meme-suite.org/)進行預(yù)測，motif最大數(shù)目為10，其他參數(shù)為默認值。

1.4 陸地棉類谷氧還蛋白家族基因染色體定位及基因表達分析

從基因組數(shù)據(jù)中提取基因在染色體上物理位置，用 Mapinspect軟件繪制染色體定位圖。以新陸早33號位材料，分別提取其根、莖、雄蕊、雌蕊、子房、葉片和花，采用有參基因組的轉(zhuǎn)錄組分析方法進行基因表達分析，結(jié)果利用TBTOOLS軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhGRL基因的鑒定與命名

利用擬南芥已鑒定的13個GRL基因及氨基酸序列為查詢序列，在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI中進行比對篩選，在陸地棉中最終獲得32個GRL家族基因，依據(jù)各基因在染色體上的位置命名為GhGRL1至GhGRL32(見表1)，其基因描述為Uncharacterized protein At5g39865。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，GhGRL基因編碼的蛋白質(zhì)長度為 230～390 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26.02～43.37 kd，理論等電點為4.56～9.48。這些GRL蛋白質(zhì)中12個基因顯酸性，20個基因顯堿性，表明其酸堿性不同。亞細胞定位預(yù)測的結(jié)果表明，陸地棉基因編碼蛋白位于細胞核、葉綠體、質(zhì)膜、線粒體、細胞質(zhì)和胞外等細胞結(jié)構(gòu)，其比例分別為36.4%、22.7%、18.2%、13.6%、6.8%、2.3%。

表1 陸地棉GhGRL基因家族Table 1 Information of GhGRL genes from Gossypium hirsutum

2.2 系統(tǒng)進化分析

利用陸地棉和擬南芥的GRL蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖1)。由進化樹顯示兩種植物中所有的GRL蛋白質(zhì)被分為了三個亞組，分別是：GRLI、GRL II、GRL III。其中，GRL I 亞組包含2 個GhGRL基因，1 個擬南芥GRL基因；GRL II 亞組包含7個GhGRL基因，3個擬南芥GRL基因；GRL III亞組中包含23個GhGRL基因和9個擬南芥GRL基因。

圖1 陸地棉和擬南芥GRL進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of GRL proteins in Gossypium hirsutum and Arabidopsis thaliana

2.3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列比對和保守基序的分析

GhGRL蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，除GhGRL24、GhGRL26含有PTZ00449和GRX-GRX-Like兩種結(jié)構(gòu)域外(圖2(a))，其他基因只含有GRX-GRX-Like一種保守結(jié)構(gòu)域(圖2(b))；多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，32個基因氨基酸序列的相似性為31.31%(見圖3)，并且C末端具有兩個CXXCX7CXXC序列(見圖3-紅色框)。蛋白保守基序的分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉GRL蛋白有10個比較保守的基序，分別命名為Motif1-Motif 10(見圖4)。這類基因C末端均包含motif 1、motif 2、motif3、motif4四個保守基序，同時這四個基序與GRL蛋白的GRX-GRX-Like結(jié)構(gòu)域(cd0301)相互重疊(見表2)。32基因中，GhGRL1、GhGRL3包含的保守基序最多，具有8個保守基序。

圖2 GhGRL 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Predicted conserved domains of GhGRL proteins

圖3 GhGRL氨基酸多重序列比對Fig.3 Alignment of multiple GhGRL domain amino acid sequences

圖4 陸地棉GRL蛋白基因基序Fig.4 Motifs patterns of GRL protein sequences

表2 陸地棉GRL蛋白10個基序的信息Table 2 Information of 10 motifs of GRL protein

2.4 GhGRL基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

對GhGRL基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，亞組Ⅰ的成員均沒有內(nèi)含子，亞組ⅡGhGRL20有4個內(nèi)含子，GhGRL5、GhGRL7、GhGRL17、GhGRL28、GhGRL29、GhGRL31均沒有內(nèi)含子，亞組Ⅲ的GhGRL1和GhGRL3有1個內(nèi)含子，GhGRL8和GhGRL21沒有內(nèi)含子(見圖5)。陸地棉GhGRL基因在基因組上分布不均勻，每條染色體上的該家族基因的數(shù)目差別很大，如D04、A09、D09、和D11染色體各含有3個GhGRL家族基因，D03、A05、A11、A13、D13染色體各有2個GhGRL家族基因，A02、A03、A04、D05、A06、D06、A08、D08、A10、D10染色體各含有1個GhGRL家族基因(見圖 6)。

圖5 GhGRL基因結(jié)構(gòu)Fig.5 Gene structure of GhGRL

圖6 GhGRL基因染色體分布Fig.6 Chromosomal distribution of GhGRL genes in Gossypium hirsutum

2.5 GhGRL基因的表達模式

分別對GhGRL基因家族在棉花根、莖、雄蕊、雌蕊、子房、葉片和花中的表達模式進行分析，結(jié)果表明(見圖7)，在根中，GhGRL8、GhGRL14兩個基因不表達，GhGRL22表現(xiàn)出最大表達水平；在莖中，GhGRL5、GhGRL8兩個基因不表達，GhGRL23表達水平最高；在雄蕊中，GhGRL12、GhGRL15、GhGRL29、GhGRL31四個基因不表達，GhGRL26表達水平最高；在雌蕊中，GhGRL12不表達，GhGRL26表達水平最高；在子房中，GhGRL5、GhGRL7、GhGRL8、GhGRL12四個基因不表達，GhGRL25表達水平最高；葉片中，GhGRL5、GhGRL7、GhGRL8三個基因不表達，GhGRL26表達水平最高；在花中，GhGRL5、GhGRL8、GhGRL12、GhGRL13、GhGRL29、GhGRL31七個基因不表達，GhGRL26表現(xiàn)出最大表達水平。相對于其他基因，GhGRL26在雄蕊、雌蕊、花和葉片四個組織中表達量都是最高。

圖7 GhGRL基因表達模式Fig.7 Expression patterns of GhGRL genes in Gossypium hirsutum

3 討 論

目前對棉花中GRL基因在全基因組水平的生物信息學(xué)分析仍未見到報道。本研究通過生物信息學(xué)分析，在陸地棉中鑒定了32個具有GRX-GRX-Like結(jié)構(gòu)域的GRL基因，并根據(jù)這些基因在染色體上的位置信息分別命名為GhGRL1-GhGRL32。與擬南芥[9]、水稻[18]、木薯[16]等植物相比陸地棉GRL基因數(shù)目明顯較多，推測陸地棉谷氧還蛋白家族成員分化可能早于擬南芥、水稻、木薯的物種分化。本次實驗對擬南芥和陸地棉谷氧還蛋白基因進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉和擬南芥的GRL基因分為3個亞組，每一個亞組都有與擬南芥同源的基因，同時每組中陸地棉谷氧還蛋白基因數(shù)量多于擬南芥，由此推測陸地棉中谷氧還蛋白家族基因可能發(fā)生了物種特異性擴增[21]。

蛋白質(zhì)處于特定的亞細胞位置上才能有效發(fā)揮其功能，因此了解亞細胞定位對研究蛋白質(zhì)功能有一定的幫助，在本研究亞細胞預(yù)測的結(jié)果表明，陸地棉基因編碼蛋白位于細胞核、葉綠體、質(zhì)膜、線粒體、細胞質(zhì)和胞外等細胞結(jié)構(gòu)，這可能與基因功能分化的多樣性有關(guān)。陸地棉GhGRL多重序列比對發(fā)現(xiàn)其氨基酸同源相似性為31.31%左右，通過保守基序和功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉GRL蛋白有10個比較保守的基序，這些保守基序又以不同的排序分布，這可能是造成GRL家族蛋白功能多樣性的某一重要因素，而在這10個基序中，motif1、motif2、motif3、motif4四個保守基序編碼功能結(jié)構(gòu)域，由此推斷，GhGRL基因編碼的蛋白在C末端具有比較保守的結(jié)構(gòu)域。

類谷氧還蛋白家族基因的結(jié)構(gòu)存在相似性，大部分該家族的基因不存在內(nèi)含子，無內(nèi)含子的基因通?？勺兗羟械陌l(fā)生概率很低，因此陸地棉GRL家族基因的功能可能會相對保守一些[22]?；蛑行∑蜠NA的插入可以改變基因的功能，也可能通過自然選擇的方法使基因消失。而這些基因組中，只有GhGRL20有四個內(nèi)含子和最長的基因長度，推測該基因在進化過程中，其結(jié)構(gòu)或者功能發(fā)生了較大變化的緣故。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)32個基因中，15個基因分布A基因組，17個基因分布D基因組，基因數(shù)量的不同可能與植物在進化過程中發(fā)生的基因復(fù)制、基因組重排、基因丟失都有關(guān)系，對此還有待進一步研究[23]。

擬南芥、木薯GRL家族基因在植物各個組織中廣泛存在[24-25]。在本次研究也發(fā)現(xiàn)GhGRL基因在根、莖、雄蕊、雌蕊、子房、葉片和花中均有表達，表明它們可能在陸地棉生長發(fā)育中發(fā)揮了廣泛的作用。相對于其他基因，GhGRL26在雄蕊、雌蕊、花和葉片四個組織中表達量都是最高，因此我們推測GhGRL26基因可能在棉花生長發(fā)育過程中起更重要的作用。

4 結(jié) 論

目前類谷氧還蛋白基因在植物中的生物功能逐漸受到重視。本研究根據(jù)擬南芥的AtGRL基因，在陸地棉中發(fā)現(xiàn)32個GhGRL基因，這些成員分為3個亞組，每個亞組成員具有相似的基因基序和基因結(jié)構(gòu)，并且GhGRL基因具有GRL蛋白特有的結(jié)構(gòu)域的和不同的染色體定位。大部分GhGRL基因在各個組織器官中均有表達。陸地棉GhGRL基因的鑒定及表達分析，為挖掘GhGRL基因的功能奠定了基礎(chǔ)。