氯雷他定的生物信息學(xué)分析及其對COVID-19的潛在治療意義

陳浩然，徐和福，陳熙勐，張皓旻，張鈞棟，智 鵬，李卓陽，劉格良，王毅興，盧學(xué)春*

(1．山西醫(yī)科大學(xué) 管理學(xué)院，太原 030000；2.天津康復(fù)療養(yǎng)中心 檢驗病理科，天津 300381；3.解放軍總醫(yī)院 第二醫(yī)學(xué)中心血液科 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853；4.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院 中醫(yī)科，上海 200120)

2019年12月，武漢發(fā)生多起不明原因肺炎。目前，已確認(rèn)該病的爆發(fā)是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起，此病毒與引起嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)的病毒高度同源。此前臨床觀察認(rèn)為，細(xì)胞因子升高誘發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是導(dǎo)致患者病情加重的原因，但這一認(rèn)識存在局限性，并不能解釋全部臨床癥狀[1-3]。目前對于危重型COVID-19患者除對癥支持治療外，缺乏有效的干預(yù)措施，盡快確定藥物治療方案對于防止輕型、普通型患者轉(zhuǎn)為重型、改善危重型患者預(yù)后具有關(guān)鍵作用。氯雷他定作為新一代抗組胺藥物，不僅能夠拮抗組胺受體，而且對其他免疫細(xì)胞和免疫因子均有抑制作用[4]。既往研究表明，氯雷他定作為抗組胺藥物，能夠減少炎癥遞質(zhì)如白三烯的釋放，抑制細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)以及降低IL-6，IL-8等細(xì)胞因子產(chǎn)生[5]，并且與熱毒寧聯(lián)用具有降低病毒易感性和嚴(yán)重程度的作用[6]，推測其對COVID-19可能具有潛在的治療作用。鑒于SARS-CoV-2的組學(xué)數(shù)據(jù)分析尚不完善，為進(jìn)一步探明氯雷他定的體內(nèi)分子機(jī)制，我們運用臨床生物信息學(xué)方法，以本課題組前期建立的EpiMed平臺為基礎(chǔ)，通過分析氯雷他定對全基因組表達(dá)譜的影響，進(jìn)行臨床生物信息學(xué)分析，并結(jié)合EpiMed平臺的預(yù)測結(jié)果，探討其抗SARS-CoV-2的潛在分子機(jī)制，為后續(xù)制定和優(yōu)化含氯雷他定的COVID-19治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源

以“Loratadine”為檢索詞在GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，在條目類型中選擇“series”，共得到10個檢索結(jié)果，為進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，對檢索結(jié)果進(jìn)行二次篩選，篩選條件為：①物種：人或與人基因同源性高的物種(小鼠、大鼠等)。②實驗設(shè)計：三組或三組以上的重復(fù)實驗。③數(shù)據(jù)類型：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)③數(shù)據(jù)質(zhì)量：數(shù)據(jù)完整以及對應(yīng)的平臺注釋文件標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范。在經(jīng)過仔細(xì)篩選后，選出符合條件的數(shù)據(jù)：GSE59927。GSE59927數(shù)據(jù)集的作用對象均為大鼠，其中包含了超過600種不同藥物或化合物樣本的表達(dá)矩陣，涵蓋了氯雷他定作用于大鼠心臟和原代肝細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.1.2 實驗設(shè)計

首先，根據(jù)氯雷他定的作用部位、作用時間以及藥物劑量，將篩選后的數(shù)據(jù)分為5組(見表1)。將正常大鼠的心臟(或原代肝細(xì)胞)作為對照組，經(jīng)過氯雷他定處理的大鼠心臟(或原代肝細(xì)胞)作為實驗組，進(jìn)行差異分析。氯雷他定作用部位、作用時間以及藥物劑量皆為GSE59927中的原始信息，考慮到藥物在不同細(xì)胞系、劑量以及時間的影響不同，去除5組差異基因中調(diào)控作用相反的交集基因，并使用R語言程序?qū)?組差異基因調(diào)控作用相同的基因表達(dá)量取平均值，得到的結(jié)果用于后續(xù)分析。

表1 樣本分組情況表Table 1 Sample grouping table

1.2 方 法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)分析

在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)網(wǎng)站下載R語言程序包，用于數(shù)據(jù)處理和差異分析[7]。首先使用Impute程序包估算表達(dá)矩陣中的缺失值[8]，使用biomaRt包對基因進(jìn)行同源轉(zhuǎn)化[9]，然后使用limma程序包對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并篩選差異基因[10]。差異基因篩選設(shè)定閾值為log2(Fold Change)>1，P<0.05。

1.2.2 差異分析結(jié)果整理

使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)[11]在線工具，去除5組差異基因中調(diào)控作用相反的交集基因，并使用R語言程序?qū)?組差異基因調(diào)控作用相同的基因表達(dá)量取平均值。

1.2.3 構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將差異基因上傳至STRING v11.0(https://string-db.org/)在線分析網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，以置信度>0.7作為閾值進(jìn)行篩選[12]。關(guān)鍵基因是指PPI網(wǎng)絡(luò)中具有高度相關(guān)的基因。在本研究中，關(guān)鍵基因為在PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中出現(xiàn)頻次最高的前10個基因，使用R軟件，通過Degree算法篩選出關(guān)鍵基因，結(jié)果輸出得分排名前10的基因[13]。

1.2.4 富集分析

使用R語言clusterProfiler包對差異基因進(jìn)行GO富集分析以及KEGG通路富集分析[14]，并使用R語言程序?qū)垲惤Y(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 疾病與藥物關(guān)聯(lián)分析

使用本研究團(tuán)隊基于“整合多組學(xué)分析”算法建立的臨床生物信息學(xué)表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測平臺(EpiMed)，對差異基因進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析[15]。以|關(guān)聯(lián)系數(shù)|>0.1，P<0.05作為閾值，篩選與氯雷他定負(fù)相關(guān)的疾病以及與氯雷他定正相關(guān)的藥物、化合物或中藥，并預(yù)測相關(guān)作用靶點。

1.2.6 文本驗證

為了驗證氯雷他定作用靶點的有效性，將10個關(guān)鍵基因作為關(guān)鍵靶點，以‘關(guān)鍵靶點’ AND ‘coronavirus’為檢索詞，在英文數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，以‘關(guān)鍵靶點’ AND ‘冠狀病毒’為檢索詞，在中文數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，并記錄相關(guān)檢索結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)分析

通過limma程序包對5組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，以|log2FC|>1，P<0.05，為閾值，得到5組差異結(jié)果，差異基因個數(shù)依次為223個、130個、169個、207個、202個，其中上調(diào)表達(dá)的基因個數(shù)依次為79個、35個、60個、86個、69個，下調(diào)表達(dá)的基因個數(shù)依次為144個、95個、109個、121個、133個(見圖1)。

圖1 各組差異表達(dá)分析結(jié)果Fig.1 Results of differential expression analysis in each group

2.2 差異分析結(jié)果整理

使用Venny 2.1工具和R語言腳本，將5組差異結(jié)果匯總，去除交集基因并求平均值后，共得到差異基因642個，其中上調(diào)230個，下調(diào)412個。

2.3 蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將差異表達(dá)基因?qū)隨TRING v11.0在線分析網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，共得到642個蛋白，1 087條相互關(guān)系，平均點度為5.56。導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化處理[16](見圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果Fig.2 Results of differentially expressed gene PPI networks

利用R語言腳本，使用Degree算法對PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行節(jié)點得分計算，篩選得到排名前10位的關(guān)鍵基因(見圖3)。

圖3 排名前10位的關(guān)鍵基因Fig.3 Top 10 hub genes注：其中包括與心臟保護(hù)相關(guān)的基因，例如ADCY2、BDKRB2、BDKRB1、CASR；與免疫相關(guān)的基因，例如CCR5、TACR1、ANXA1；與激素和跨膜信號相關(guān)的基因，例如PIK3R1、GNG8；與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，例如APOB.

2.4 富集分析

使用R程序語言clusterProfiler包對差異基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集。GO富集分析共得到311條結(jié)果，其中包括生物學(xué)過程(Biological Process，BP)241條，細(xì)胞組分(Cellular Components，CC)29條，分子功能(Molecular Function，MF)41條(見圖4)。在生物學(xué)過程方面，富集的基因大多與免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子、趨化因子、激素作用、糖脂代謝有關(guān)，如IL18、IFNG、LRP1、TNF、TGFB1、KCNA4、GCGR、APOB、LDLR等。在細(xì)胞組分方面，富集的基因大多參與炎癥調(diào)節(jié)過程，如C1S、CD3D、CD4等。在分子功能方面，富集的基因大多與免疫反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)和跨膜運輸有關(guān)，如CCR5、GCGR、SLC4A1、SLC5A5、SLC5A7、SLC18A3、SLC38A2等。

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO enrichment analysis注：富集基因主要參與免疫反應(yīng)，趨化因子作用，激素作用，分子代謝調(diào)節(jié)和藥物代謝等過程.

KEGG通路共富集通路305條，富集的通路主要與補體和凝血系統(tǒng)，炎癥反應(yīng)，心律失常，氧化應(yīng)激和病毒感染等相關(guān)功能或過程。(見圖5，圖6)。

圖5 KEGG 通路富集分析結(jié)果 Fig.5 Results of KEGG pathway enrichment analysis注：其富集途徑主要與補體和凝血系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、心律失常、氧化應(yīng)激和病毒感染等有關(guān).

圖6 部分重要信號通路Fig.6 Some significant signal pathways

2.5 疾病關(guān)聯(lián)分析與藥物關(guān)聯(lián)分析

使用EpiMed平臺對疾病與藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以關(guān)聯(lián)系數(shù)<-0.1，P<0.05作為閾值，篩選出與氯雷他定負(fù)相關(guān)的疾病，預(yù)測結(jié)果多集中于炎癥疾病、病毒性疾病、免疫相關(guān)疾病，包括SARS、流行性感冒、全身炎癥反應(yīng)綜合征、呼吸道合胞體病毒感染和社區(qū)獲得性肺炎，同時，以關(guān)聯(lián)系數(shù)>0.1，P<0.05作為閾值篩選出與氯雷他定正相關(guān)的藥物，預(yù)測結(jié)果包括TNF-α抑制劑(Etanercept)、抗病毒藥物泛昔洛韋(Famciclovir)、奈韋拉平(Nevirapine)，免疫調(diào)節(jié)藥物氟伐他汀(Fluvastatin)以及抗炎藥磷酸氯喹(Chloroquine)等，預(yù)測出與氯雷他定正相關(guān)的中藥，包含虎杖(Polygonum cuspidatum)，魚腥草(Houttuynia cordata)，連翹(Forsythia)，甘草(Liquorice)，知母(Common anemarrhena rhizome)(見表2)。

表2 氯雷他定的正負(fù)相關(guān)分析的部分結(jié)果Table 2 Partial results of loratadine positive and negative correlation analysis

續(xù)(表2) 名稱類型關(guān)聯(lián)系數(shù)P值關(guān)聯(lián)靶點全身炎癥反應(yīng)綜合征(SystemicInflammatoryResponseSyndrome)疾病-0.43708.96×10-14CD48,RHOA,IFIT1B,STAT5A,NAP1L4,CCL5,LITAF,RPL18,SELENBP1,WBP2,NFE2,FDFT1,VIM,ALAS2,LGALS1,ABCA1,GMFG,SLC7A5,BCL2L1,S100A4,SLC4A1,PDZK1IP1,CIB1,LCP1,BCAP31,CEBPD,MAFB,IRF1,ANXA1,RGS2,IL18,FCN1,FGL2,S100A9呼吸道合胞體病毒感染(RespiratorySyncytialVirusInfections)疾病-0.56222.42×10-13LGALS1,STK38,AIF1,SOD1,RGS2,LCP1,FCN1,FGL2,CIB1,STAT5A,RPL18,S100A9,IL18,HSD17B7,CD3D,CCL5,BCL2L1,DYNLL1,CUTA,LITAF,RPS11,OGT,VIM,FKBP5,NAP1L4,S100A4,SLC4A1,SLC44A4,ALAS2,CEBPD,CCND2,WBP2,PSMA4,IFIT1B,NFE2社區(qū)獲得性肺炎/嚴(yán)重膿毒癥(Communityacquiredpneumonia/severesepsis)疾病-0.30704.79×10-7HERPUD1,VIM,ARHGAP4,G0S2,SPARC,GZMA,ALAS2,TIMP2,CEBPD,GMFG,DUSP2,S100A9,RPS11,LGALS1,C15orf48,ZFP36L2,DYNLL1,MAFB,RPL18,RHOA,PLAUR,AREG,WDR1,NFE2,FCER1A,SPON2,AIF1,FCN1,FGL2,RGS2,HCN2,F5,PSMB4,S100A4,PLAU,JUNB,LGALS2NF-α抑制劑(Etanercept)西藥0.21161.51×10-14LGALS1,FGL2,ALAS2,PPM1F,CIB1,MAFB,IL18,PDXK,CEBPD,LCP1,VIM,RPL18,HSD17B7,CBX7,SOD1,SLC4A1,LITAF,DYNLL1,IRF1,BCL2L1,FCN1,S100A9,RPS11,S100A4,LDHB,WBP2,SELENBP1,PLOD1,CTSH,MBP,NAP1L4,FCER1A,CCL5泛昔洛韋(Famciclovir)西藥0.61511.77×10-15PSMA4,C1S,KCNA2,LRPAP1,HAO2,SERPIND1,CYP2F1,G0S2,FADS1,CIB1,TNFSF12,AIF1,FGB,RPS11,MVD,DIO1,CYP7A1,C4BPB,CRYM,ENPP2,NFE2L2,GCHFR,ORM1,NREP,AKR7A3,ITIH4,RPL18,HRG,CYP2E1,DGAT2,ACLY,NUPR1,GCK,FKBP5,CXCL12,PFKFB1,AKAP4,PECR,ADH6,REEP6,HSD17B2,BCAP31,PAH,SOD1,BAAT,RAI14,OTC,HAL,NIPSNAP1,DNAJA2,CP,TAT,FASN,SULT1B1,CA3,KLKB1,RBP1,FDFT1,PLAU,FADS2,DPYS,ALB,AK3,DDC,PEMT,HERPUD1,CBS,SELENBP1,KHK,GRPEL1,HMGCS1,ACOX2,ADIPOR2,HPN,EPHX1,ALAS2,IDI1,SERPINA3,CDO1,CTH,CTSH,FABP1,PON1,TACR1,AVPR1A,KYNU奈韋拉平(Nevirapine)西藥0.39511.45×10-17POM121C,DIO1,PON1,GRPEL1,PKLR,BAAT,SERPIND1,SELENBP1,HMGCS1,KHK,PSMB4,TFRC,CHST10,HRG,GCK,AADAC,FGB,SLC6A13,RELN,CTH,ITIH4,CXCL12,INHBE,DDC,HSD17B6,KCNA2,SCN4A,PLAU,RBP1,ABCC2,PPP2R1B,F5,FBP1,LRPAP1,NIPSNAP1,ENPP2,TARBP2,CYP2E1,NFE2L2,ARG1,ACLY,G0S2,WBP2,TNF,HAO2,ALB,CA3,TM4SF4,FASN,MAG,SPARC,CP,EPHX1,TCEA3,ACAT1,TACR1,HSD17B2,FABP1,MVD,ALDH6A1,FMO1,RPL18,OTC,CRYM,RPS11,NAP1L4,AKR7A3,PAH,CYP7A1,MAL2,POM121,CDO1,CTSH,C4BPB,FADS1,CSRP1,DGAT2,ADORA3,ALAS2,REEP6,TAT,FADS2,AVPR1A,SOD1,PFKFB1,AKAP4,ALDH3A2,PECR,PSMA4,GCLM,AOX1,NREP氟伐他汀(Fluvastatin)西藥0.30621.64×10-18AADAC,DIO1,CYP2F1,RPS11,HAO2,COL5A1,SPARC,HPN,ACLY,PPM1F,OTC,HSPB3,HAL,ABTB2,AP2M1,EPHX1,PAH,FBP1,SLC38A2,GDA,PLAU,MAG,AIF1,PFKFB1,TNF,ADIPOR2,RPL18,CYP2E1,ADORA3,KYNU,PON1,ADORA1,C8B,ATRN,MFN2,NFE2L2,MVD,BAAT,DUSP2,FDFT1,IDI1,ELN,TM4SF4,SERPIND1,PECR,AACS,INHBE,RELN,ALB,CBS,MASP2,ENPP2,NUPR1,LSS,PEMT,LRPAP1,ORM1,F5,SOD1,RAI14,GRPEL1,SQLE,AVPR1A,LRP1,PSMA4,HSD17B7,DPYS,C4BPB,HRG,CP,SPON2,HSD17B6,KHK,HERPUD1,SCN4A,HSD17B2,AKAP4,ITIH4,FABP1,FGB,CLDN3,FASN,ARG1,ALDH3A2,CYP7A1,SELENBP1,CA3,KCNA2,ADH6,RBP1,NREP

續(xù)(表2) 名稱類型關(guān)聯(lián)系數(shù)P值關(guān)聯(lián)靶點磷酸氯喹(ChloroquinePhosphate)西藥0.20127.93×10-8PON1,PSAT1,BAAT,KHK,HMGCS1,HRG,ALDOC,TFRC,SELENBP1,SQLE,FDFT1,ASNS,IDI1,SLC3A2,AGRN,ITIH4,RBP1,RHOA,NR0B2,IFRD1,NDRG1,NME3,KCNA2,CLDN3,GBE1,HAVCR1,CP,EPHX1,CYP2E1,SLC38A2,PSPH,IRF7,ORM2,ORM1,WBP2,TM4SF4,VEGFB,NAP1L4,G0S2,ACTA1,SLC2A1,GPNMB,LITAF,DPP7,ACLY,CUTA,NFE2L2,CA3,RPS11,FABP1,AKR7A3,FASN,ALB,DUSP2,ABCF1,GDA,TCEA3,NUPR1,AP2M1,MAP2K1,TACR1,LRPAP1,PAH,MAL2,HAO2,AOX1,GTPBP2,LSS,ADORA3,SOD1,PECR,NREP,FADS1,CSRP1,CDO1,DGAT2,GCLM,REEP6,ALDH3A2,PSMA4,AVPR1A,NQO1虎杖(Polygonumcuspidatum)中藥0.44573.11×10-20IL18,TNF,LEPR,ABCA1,TNF,ABCA1,VIM魚腥草(Houttuyniacordata)中藥0.67476.97×10-15TNF,JAK2連翹(Forsythia)中藥0.15293.51×10-08TGFB1,TNF,LEPR,IGFBP2,PDGFRB,COL1A1,HTR2A甘草(Liquorice)中藥0.12716.25×10-09TNF知母(Commonanemarrhenarhizome)中藥0.37524.51×10-13SELENBP1,IL18

2.6 文本驗證

為了驗證EpiMed平臺預(yù)測出的氯雷他定相關(guān)作用靶點的有效性，我們選取10個關(guān)鍵靶點，包括PIK3R1、GNG8、ANXA1、CASR、BDKRB1、BDKRB2、ADCY2、TACR1、APOB、CCR5，分別在中、英文數(shù)據(jù)庫中檢索冠狀病毒與上述靶點作用相關(guān)的文獻(xiàn)(見表3)。結(jié)果表明，上述關(guān)鍵靶點在冠狀病毒感染患者中，主要參與抗病毒反應(yīng)、炎性因子的抑制、趨化因子調(diào)控、跨膜信號傳導(dǎo)、糖脂代謝、磷酸化等過程，對冠狀病毒感染及其造成的免疫損傷有一定的抑制作用。

表3 文本驗證結(jié)果Table 3 Results of text mining for verification

3 討 論

目前，全球為遏制SARS-CoV-2已做出了巨大努力，但病毒的傳播已經(jīng)達(dá)到了大流行的水平。遺憾的是，治療新冠病毒的療法和疫苗開發(fā)仍處于早期階段，已有研究表明，一些藥物對COVID-19患者的治療有效，但缺乏相關(guān)臨床證據(jù)，可能會導(dǎo)致不可預(yù)測的臨床預(yù)后效果，因此，快速篩選目前已經(jīng)過批準(zhǔn)的以及效果良好的藥物可能是一種更實用的方法[31]。

本研究以氯雷他定的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為研究對象，經(jīng)臨床生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，氯雷他定對COVID-19的治療作用是個多靶點的組學(xué)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，關(guān)鍵的基因如PIK3R1、GNG8、ANXA1、CASR、BDKRB1、BDKRB2、ADCY2、TACR1、APOB、CCR5等，與以往研究結(jié)果一致[17-30]，這些基因主要參與跨膜信號傳導(dǎo)、胰島素的代謝、免疫監(jiān)視、炎癥反應(yīng)、器官保護(hù)、維持鈣穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細(xì)胞周期、補體和凝血等過程。Sille等[32]研究發(fā)現(xiàn)，GNG8參與控制白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的趨化因子信號，并在神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸能、膽堿能、GABA能和多巴胺能突觸的幾條通路中發(fā)揮作用。Fox等[33]研究發(fā)現(xiàn)，CCR5是一種表達(dá)在白細(xì)胞上的趨化因子受體，趨化因子刺激CCR5觸發(fā)了趨化因子結(jié)合的CCR5分子的內(nèi)在化，使CCR5下調(diào)，有助于趨化因子的抗病毒活性。Zhang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，CASR下調(diào)有助于減輕缺氧/復(fù)氧(A/R)心肌細(xì)胞的鈣超載，具有一定的心臟保護(hù)功能。Zhou等[35]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞AKR7A通過減少惡性肝細(xì)胞對脂質(zhì)的利用來調(diào)節(jié)APOB的表達(dá)，對AFB1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。綜上所述，關(guān)鍵基因的調(diào)控在氯雷他定治療COVID-19患者過程中可能發(fā)揮著重要作用，一方面氯雷他定上調(diào)GNG8等基因，下調(diào)CCR5等基因，可能具有控制白細(xì)胞遷移、降低中性粒細(xì)胞浸潤程度、抑制細(xì)胞因子表達(dá)、防止因大量細(xì)胞因子趨化造成的細(xì)胞因子風(fēng)暴，抑制炎癥反應(yīng)等作用。另一方面，氯雷他定通過下調(diào)CASR、APOB等基因，可能具有清除免疫復(fù)合物、減輕免疫應(yīng)答、抑制鈣紊亂的功能，在清除病毒、抑制免疫反應(yīng)的同時，起著一定的器官保護(hù)的作用。

在GO富集分析結(jié)果中，生物學(xué)過程方面，氯雷他定主要參與細(xì)胞外刺激反應(yīng)，糖脂代謝，鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等過程；在細(xì)胞組分方面，主要影響跨膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物，離子通道復(fù)合體以及頂端質(zhì)膜、基底外側(cè)質(zhì)膜、突觸膜等多種膜的構(gòu)成；在分子功能方面，主要與多種離子通道轉(zhuǎn)運蛋白活性，激素調(diào)節(jié)，糖蛋白結(jié)合等功能相關(guān)。本研究認(rèn)為，氯雷他定可能通過阻斷跨膜運輸，調(diào)控糖脂代謝，調(diào)節(jié)多種激素作用和趨化因子活性來減輕病毒引起的炎癥反應(yīng)與免疫失調(diào)，維持鈣離子穩(wěn)態(tài)并起到一定的器官保護(hù)作用。

在KEGG通路富集方面，氯雷他定主要作用于機(jī)體補體和凝血系統(tǒng)，氧，炎癥反應(yīng)，心律失常，氧化應(yīng)激和病毒感染等相關(guān)功能或過程。Hunto等[36]研究發(fā)現(xiàn)，氯雷他定抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，并抑制Syk/Src介導(dǎo)的NF-κB通路，從而抑制變態(tài)反應(yīng)，并作為抑制劑，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的蛋白活性。Zhou等[37]研究發(fā)現(xiàn)，氯雷他定能有效抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、活性氧和血管黏附分子的產(chǎn)生以及VCAM-1、E-選擇素、TNF-α、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，有效地阻斷了氧化低密度脂蛋白(LDL)誘導(dǎo)的JNK的激活，以及AP-1和NF-κB信號通路，提示了氯雷他定在內(nèi)皮保護(hù)中的作用。Tontonoz等[38]研究發(fā)現(xiàn)，激活PPARG可以促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，減少LDL的攝取。PPARG激動劑具有抑制心肌細(xì)胞肥大和心肌炎癥反應(yīng)的作用，在ACE2突變小鼠中PPARG信號的激活導(dǎo)致心肌損傷減輕，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在此過程中起著關(guān)鍵作用?？傊?，本研究認(rèn)為，氯雷他定不僅具有傳統(tǒng)的抗組胺作用，其作用于機(jī)體后，可能會激活PPAR信號通路、MAPK信號通路等通路，抑制NF-κB信號通路，AP-1信號通路等通路，從而抑制了IL-1、IL-6等多種細(xì)胞因子以及其他分子的表達(dá)，阻斷了JNK、AP-1等通路的激活，減少對LDL的攝取，具有一定的抑制炎癥，減少器官損傷的作用。

為了進(jìn)一步驗證氯雷他定相關(guān)作用靶點的可靠性，我們選取10個關(guān)鍵基因(PIK3R1、GNG8、ANXA1、CASR、BDKRB1、BDKRB2、ADCY2、TACR1、APOB、CCR5)在中英文數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示10個關(guān)鍵基因均與冠狀病毒密切相關(guān)，López-Cortés等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白和SARS-CoV-2相關(guān)的人類蛋白之間建立PPI網(wǎng)絡(luò)，中心度最高的為UBA52，其次為GNB1、APP、FPR2、NCBP1、NCBP2、KNG1、PIK3CA、PIK3R1。Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在傳染性支氣管炎病毒感染氣管中ANXA1下調(diào)，提示ANXA1的表達(dá)降低可能與呼吸道病毒感染過程中的炎癥表型有關(guān)。Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，感染SARS-CoV后，肺中的趨化因子受體CCR5上調(diào)，CCR5 mRNA轉(zhuǎn)錄增加9倍，這些受體轉(zhuǎn)錄本表達(dá)增強與其配體在SARS冠狀病毒感染的肺中上調(diào)密切相關(guān)。因此，本研究認(rèn)為，上述10個關(guān)鍵基因在氯雷他定治療COVID-19中或許起著重要作用，其對炎癥調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制以及對免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用有待進(jìn)一步研究加以證實。

本研究基于前期建立的EpiMed表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測平臺[39]，對氯雷他定開展關(guān)聯(lián)分析。在疾病關(guān)聯(lián)分析方面，發(fā)現(xiàn)氯雷他定與SARS、流行性感冒、全身炎癥反應(yīng)綜合征、呼吸道合胞體病毒感染和社區(qū)獲得性肺炎等感染性疾病呈負(fù)相關(guān)，提示氯雷他定對COVID-19可能具有類似作用。在藥物關(guān)聯(lián)分析方面，發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制劑依那西普、抗病毒藥物泛昔洛韋、奈韋拉平，免疫調(diào)節(jié)藥物氟伐他汀以及抗炎藥氯喹等西藥，虎杖，魚腥草，連翹，甘草，知母等中藥與氯雷他定正相關(guān)，提示其與氯雷他定可能具有潛在協(xié)同作用。綜上所述，氯雷他定對COVID-19具有潛在治療作用，在臨床可考慮與上述正相關(guān)藥物進(jìn)行聯(lián)合治療，以上結(jié)果均有待進(jìn)一步臨床及基礎(chǔ)研究驗證。

總之，氯雷他定不僅是一種傳統(tǒng)的抗組胺藥物，其作用于機(jī)體能產(chǎn)生全基因組范圍的影響，通過抑制多種細(xì)胞因子，可能會減輕COVID-19危、重患者體內(nèi)細(xì)胞因子風(fēng)暴造成的多器官損傷，在抑制炎癥反應(yīng)、器官保護(hù)等方面可能也有著重要作用。本研究使用課題組前期建立的EpiMed平臺，分析預(yù)測了氯雷他定調(diào)控的分子靶點以及可能具有相似治療作用的藥物，對于制定包含氯雷他定的COVID-19危重癥患者治療方案具有一定的指導(dǎo)意義。