康益膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激的影響

丁培娜，崔應(yīng)麟，王雪可，陳冠廷

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

缺血性腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。對(duì)于腦血管疾病的治療，及早恢復(fù)缺血腦組織血流灌注、改善局部供氧，是降低其病死率、致殘率的重要手段之一。但在恢復(fù)血流灌注后, 則可能出現(xiàn)更為嚴(yán)重的腦組織結(jié)構(gòu)及功能的損害, 稱(chēng)為缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion, I/R)[1]。因此，腦缺血再灌注損傷后的診療，受到越來(lái)越多的重視,而中藥制劑在此方面，獲得了顯著的療效[2]。腦梗死屬中風(fēng)的范疇，究其病因病機(jī)，主要是以虛為本，以風(fēng)、痰、瘀、火為標(biāo)，其中又以氣虛致脈道不利、瘀血阻絡(luò)為多見(jiàn)[3]?？狄婺z囊是在前人基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)特點(diǎn)，篩選的有效藥物組成，具有益氣活血、通絡(luò)祛濁之功效。

本實(shí)驗(yàn)采取線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈急性腦梗死模型，主要觀察康益膠囊對(duì)腦缺血再灌注損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、腦組織氧化應(yīng)激水平的影響，探討康益膠囊的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量(210±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(京)2016-0011。大鼠分籠喂養(yǎng)，在室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度40%～60%、自然光照情況下給予充足的水和食物，自然晝夜循環(huán)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

水合氯醛(北京索萊寶科技有限公司, 批號(hào)：T8590)；CPA324S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)； H1650型離心機(jī) (湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；5417型低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；脫水機(jī)(德國(guó) LEICA AS P300)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、 過(guò)氧化物酶(LDH)(南京建成生物工程研究所)。

1.3 藥物

康益膠囊(由河南省中醫(yī)院自制)是依據(jù)急性中風(fēng)的病因病機(jī)特點(diǎn)，由紅參、丹參、三七、土鱉蟲(chóng)、水蛭、大黃按照1∶3∶1∶2∶1∶0.6的比例研末配制而成,具有益氣活血、通絡(luò)祛濁之功效；銀杏葉片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027949，9.6 mg∶2.4 mg/片)。兩種藥物均配置成混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 模型制備

參考Longa的實(shí)驗(yàn)方法[4]，略作改良后制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。所有大鼠禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后的大鼠，仰臥位固定在手術(shù)板上，頸正中線開(kāi)口，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，避免刺激迷走神經(jīng)。在CCA近心端和ECA近端、緊鄰分叉處各置一根絲線并結(jié)扎，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在CCA上距ICA、CCA分叉4 mm地方剪一“V”形切口，將栓線圓鈍端沿切口插入ICA，緩緩向前推進(jìn)18～20 mm，稍遇阻力即停止前進(jìn)。結(jié)扎，固定栓線和防止出血，逐層縫合傷口，栓線末端留1 cm于皮外。2 h后拔出線拴，形成再灌注。假手術(shù)組的大鼠不插入線拴，只分離血管。

按照Z(yǔ)ea-Longa′s五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法，術(shù)后2 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為癥狀評(píng)分。評(píng)分方法見(jiàn)表1。評(píng)分在1～3分者為造模成功，評(píng)分為0分、4分及生命體征不平穩(wěn)的動(dòng)物剔除。

表1 Zea Longa's五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、康益膠囊低劑量組和康益膠囊中劑量組、康益膠囊高劑量組和銀杏葉組,共6組，每組12只。結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組給藥劑量按照人和大鼠體表面積換算，人與大鼠的換算系數(shù)為0.018[5]，康益膠囊低劑量組給予75 mg/kg混懸液，康益膠囊中劑量組給予150 mg/kg混懸液，康益膠囊高劑量組給予300 mg/kg混懸液，陽(yáng)性藥物組給予銀杏葉片150 mg/kg混懸液，模型組、假手術(shù)組則灌胃相同體積的溶劑對(duì)照。再灌注后24 h開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃14 d。

2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3.1 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)期間每天觀察并記錄大鼠活動(dòng)、飲食情況、精神狀況、體質(zhì)量變化等。

2.3.2 神經(jīng)行為恢復(fù)評(píng)分

采用改良神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)[6]評(píng)估康益膠囊對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。于術(shù)后24 h、第3天、第7天、第14天分別評(píng)分，每次固定在同一時(shí)間點(diǎn)完成。mNSS總分為18分，神經(jīng)功能損傷程度隨分值增大而加重，其中0～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

2.3.3 大鼠腦組織中的含水量

第14天評(píng)分后，每組大鼠隨機(jī)選取6只，麻醉后斷頭取腦，剝離腦組織，生理鹽水沖洗，嗅球、低位腦干及小腦去除，用濾紙吸干水分后稱(chēng)重(腦濕重)。置于100 ℃的烘箱中烘烤 24 h后再稱(chēng)重(腦干重)[7]。

腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%

2.3.4 大鼠腦組織中CAT、GSH-Px活性和LDH含量的檢測(cè)

將各組剩余6只大鼠，處死后斷頭取腦，冰盒內(nèi)快速分離大腦，取部分右側(cè)大腦半球，準(zhǔn)確稱(chēng)重后，按照1∶9的比例加入預(yù)冷至4 ℃的生理鹽水，在冰上研磨制備成10%組織勻漿，然后在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定CAT、GSH-Px的活性和LDH含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

康益膠囊各劑量組灌胃期間，大鼠活動(dòng)、精神、飲食、體質(zhì)量與余組大鼠無(wú)明顯差異。

3.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)比較

假手術(shù)組沒(méi)有神經(jīng)功能缺損；灌胃前，其余各組間神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異(P>0.05)。灌胃14 d后，模型組神經(jīng)功能缺損改善不明顯；康益膠囊低、中、高劑量組和銀杏葉組神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；高劑量組較銀杏葉組改善更明顯(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分比較分)

3.3 大鼠腦組織含水量的比較

模型組大鼠的腦組織含水量均明顯升高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01);康益膠囊低、中、高劑量組較模型組腦含水量明顯降低 (P<0.05，P<0.01)；高劑量組與銀杏葉組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦缺血后腦組織含水量的比較

3.4 大鼠腦缺血再灌注腦組織CAT、GSH-Px活性的比較

與假手術(shù)組相比，模型組CAT、GSH-Px的活性顯著下降 (P<0.01);康益膠囊中劑量組及高劑量組CAT活性明顯高于模型組 (P<0.05) ;康益膠囊各組及銀杏葉組GSH-Px活性明顯高于模型組 (P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦缺血再灌注腦組織CAT、GSH-Px活性的比較

3.5 大鼠腦缺血再灌注腦組織中LDH水平的比較

與假手術(shù)組相比，模型組LDH的含有量顯著增加(P<0.01)；康益膠囊各組及銀杏葉組LDH的含量明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腦缺血再灌注腦組織LDH含量的比較

4 討論

腦梗死后局部腦組織缺血和缺氧，進(jìn)一步引起病灶處組織軟化、壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。及時(shí)恢復(fù)血流灌注是目前最佳治療方案。研究顯示[8]，再灌注治療可拯救即將死亡的細(xì)胞，在功能上恢復(fù)可逆性損傷，但大量自由基的生成、氧化應(yīng)激的激活等仍會(huì)持續(xù)損傷腦組織進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損癥狀。在健康狀態(tài)下，腦內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，使腦內(nèi)的氧化作用與抗氧化作用處于平衡狀態(tài)，保證神經(jīng)系統(tǒng)功能正常，其中的酶抗氧化系統(tǒng)，包括有CAT、GSH-Px等，它們?cè)谧杂苫纳?、清除及過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的中止等方面發(fā)揮著重要作用。腦缺血再灌注損傷時(shí)，自由基就會(huì)大量生成，同時(shí)自由基清除酶活性也會(huì)下降，導(dǎo)致自由基清除率降低，自由基大量蓄積，體內(nèi)抗氧化能力紊亂，損害腦神經(jīng)功能[9-11]。大量自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，致使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子氧化損壞，蛋白質(zhì)氧化引起蛋白質(zhì)羥基的生成[12-13]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是人體內(nèi)的自由基清除酶、水溶性過(guò)氧化物分解酶，可以起神經(jīng)保護(hù)的作用，其活性能夠反映機(jī)體自由基清除的能力[14]；過(guò)氧化氫酶(CAT) 是具有還原活性的抗氧化酶，能減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，其活性可以反應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活狀態(tài)[15]；腦細(xì)胞在急性缺氧狀態(tài)會(huì)釋放大量乳酸脫氫酶(LDH)，LDH可作為反映神經(jīng)元損傷情況的指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，大鼠在腦缺血再灌注后，神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，腦水腫顯著，腦組織中自由基清除酶如CAT、GSH-Px的活性明顯降低，LDH含量明顯升高，腦損傷明顯。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，康益膠囊可明顯促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損癥狀的恢復(fù);顯著降低腦組織含水量;提高M(jìn)CAO 后大鼠腦組織中CAT、GSH-Px等的活性，明顯降低LDH的含量。可見(jiàn)，康益膠囊具有明顯的修復(fù)神經(jīng)功能缺損、降腦水腫和抗氧化的作用，對(duì)大鼠缺血性損傷起到修復(fù)作用。