基于氧化應(yīng)激損傷保護的玉竹多糖降糖活性機制研究

肖作奇，潘濤，邱盼子，歐陽波

(湖南省婦幼保健院藥學制劑部，湖南 長沙 410008)

玉竹為百合科植物玉竹[Polygatumodoratum(Mill.)Druce]的干燥根莖，湘產(chǎn)玉竹是國產(chǎn)玉竹中道地藥材的一種?！侗静菡x》準確提出其有“治津液枯涸，口渴嗌干等癥，而胃火制熱，燥渴消谷，多食易饑者，尤為捷效”[1],是中醫(yī)學治療糖尿病的常用藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明,玉竹主要成分為揮發(fā)油、黃酮、多糖、氨基酸、皂苷等[2]，其中玉竹總黃酮[3]、二氫異黃酮[4]等均具有抗糖尿病活性。玉竹中的生物堿成分也被證實具有降糖作用，劉梓晗等首次分離8個生物堿類化合物，并證實其有顯著的糖苷酶抑制活性[5]。但是大多的研究認為,玉竹中的多糖是治療糖尿病的主要活性成分[6]。丁登峰等分離得到玉竹褐色多糖粗提物，并用于大鼠鏈脲佐菌素糖尿病模型,證明了提取物有降糖作用[7]。還有研究者提出玉竹多糖對糖尿病大鼠胰島β細胞損傷有顯著改善作用[8]。Park S等比較了玉竹、黃柏等多種中藥材，發(fā)現(xiàn)均能改善Min6細胞上的胰島素抵抗[9]。然而，近10年對玉竹多糖(POP)的改善胰島素抵抗作用機制的研究尚未見系統(tǒng)闡述。因此筆者運用HepG2細胞系進行體外研究，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的體外胰島素抵抗和氧化應(yīng)激損傷，探究玉竹多糖的降糖活性機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

玉竹(衡東縣中藥飲片廠，批號：20170503)；胰島素(CAS# 11061-68-0)、羅格列酮(CAS#122320-73-4)(Sigma)；DEAE-52(美國Sigma公司分裝)；AB-8大孔樹脂(廊坊淼陽化工有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(BNCC341433)；胎牛血清(FBS, BNCC344675)、HepG2細胞(BNCC316757)(北納生物)；BPS、CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；葡萄糖、SOD、MDA、GSH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蛋白定量檢測試劑盒、S-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技)；H2O2等其他化學試劑(國藥集團)。

1.1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；紫外分光光度計；CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺；DP72奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS)；D-37520高速離心機(Thermo Fisher Scientific)；多功能酶標儀(奧豪斯儀器有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 藥物處置及分組

正常對照組(NC)：不加任何藥物處置；胰島素抵抗模型組(IR)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后不加其他任何藥物；羅格列酮組(RGZ)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加2 mg/mL羅格列酮作為陽性對照；低劑量POP組(IR+1 mg/mL POP)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加1 mg/mL POP；高劑量POP組(IR+10 mg/mL POP)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加10 mg/mL POP。藥物孵育24 h后，除NC組外，其余各組加10 μL 0.3%H2O2溶液。每組實驗每次設(shè)置3個平行樣，每個實驗重復(fù)進行3次。

1.3 方法

1.3.1 POP制備

選用湘玉竹飲片粉碎后，過60目篩。用20倍體積的石油醚熱回流脫脂。熱水提取3次，每次10倍水，80 ℃下攪拌提取，合并提取液，減壓濃縮至10%，攪拌下緩慢加乙醇至80%醇沉比，取沉淀冷凍干燥得到粗多糖。粗多糖經(jīng)過AB-8大孔樹脂脫色[6]，Sevage法脫蛋白[10]，在經(jīng)過DEAE過柱，分別用去離子水，0.1 mol/L NaCl洗脫，分離得到精制的POP,硫酸-苯酚法[10]測定樣品中POP含量。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與細胞模型制備

HepG2細胞使用含10%FBS的DMEM，5% CO2，37 ℃下培養(yǎng)。經(jīng)過10次傳代后選用細胞狀態(tài)良好的細胞制備胰島素抵抗HepG2細胞模型：將HepG2細胞置于含1 μmol/L胰島素的無血清培養(yǎng)基中24 h以上，葡萄糖的消耗量明顯減少(P<0.01)時為成功誘導(dǎo)出胰島素模型[11]。進行藥物處置時更換不含F(xiàn)BS的DMEM。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞活力

更換不含F(xiàn)BS的DMEM，在培養(yǎng)基中加入梯度濃度的POP，即POP終濃度分別為0、0.1、1、5、10 mg/mL。另設(shè)置一組加造模劑量的胰島素(0.1 μmol/L insulin)，正常對照組為等體積DMEM不加藥物，按1.5×103個/孔細胞密度接種于96孔板中，24 h后，加CCK-8反應(yīng)液4 h，按CCK-8試劑盒使用說明說操作，在490 nm處檢測吸光度，計算細胞活力。

細胞活力(%)=各組吸光度值/正常對照組吸光度均值×100%

1.3.4 葡萄糖消耗實驗

將HepG2細胞和IR-CM細胞分別更換含藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，在96孔板中加入試劑盒中檢測試劑(由試劑2酶溶液和試劑3酚試劑按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，200 μL，再加入各組細胞上清液10 μL。設(shè)置空白孔。充分震蕩混勻，反應(yīng)15 min后，于505 nm處檢測吸光度。

葡萄糖消耗比(%)=[(樣品吸光度-空白孔吸光度)/(對照組吸光度均值-空白孔)-1]×100%

1.3.5 氧化應(yīng)激指標檢測

細胞完成藥物處置培養(yǎng)后，收集樣品，用細胞裂解液裂解(冰浴)。于4 ℃，4 000 rpm離心5 min，收集沉淀。分別按照試劑盒說明書測定樣品SOD、MDA和總GSH水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡實驗

細胞完成孵育后，棄上清，PBS洗滌2次，加細胞裂解液，轉(zhuǎn)移細胞樣品至冰浴中，用勻漿器碾磨30 min，于4 ℃，15 000 rpm離心5 min，取上清液測總蛋白濃度。用10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，孵育一抗PI3K/PPARγ，過夜，孵育二抗。顯影成像,Image-J6.0分析PI3K/PPARγ蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。用單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett’st檢驗進行統(tǒng)計評價。采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 POP提取分離純化

玉竹多糖提取率7.97%，經(jīng)過脫色、去蛋白后過柱，去離子水洗脫分離得到中性多糖組分Ⅰ(即本文活性研究對象POP)，占玉竹粗多糖67.5%。經(jīng)硫酸-苯酚法測定樣品中POP含量為92.8%。DEAE-2纖維素洗脫曲線見圖1。

注：Ⅰ去離子水洗脫組分(POP)；Ⅱ0.1 mol/L NaCl洗脫組分。圖1 玉竹多糖DEAE-52洗脫曲線

2.2 POP對氧化應(yīng)激損傷HepG2細胞的保護作用

0.01～10 mg/mL濃度的POP對正常培養(yǎng)的HepG2細胞增殖均沒有顯著的影響，各組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),結(jié)果見表1。高劑量POP對H2O2誘導(dǎo)的HepG2氧化應(yīng)激損傷細胞有保護作用，作用同RGZ。高劑量POP組較模型組細胞活性有顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。實驗結(jié)果提示,玉竹中性多糖幾乎沒有HepG2細胞毒性，且對H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷有顯著的改善作用。

表1 玉竹多糖對胰島素抵抗HepG2和正常HepG2細胞活力的影響

表2 玉竹多糖對氧化應(yīng)激損傷的胰島素抵抗HepG2細胞活力的影響

2.3 POP對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗能力的影響

胰島素誘發(fā)產(chǎn)生胰島素抵抗后，細胞的葡萄糖消耗水平顯著下降(P<0.01)，陽性藥物RGZ和不同濃度的POP能顯著增加胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗(P<0.01)，結(jié)果見表3。

表3 玉竹多糖對胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗水平的影響

2.4 POP對胰島素抵抗HepG2細胞中SOD、GSH和MDA水平的影響

在細胞給藥24 h后，檢測細胞內(nèi)SOD、GSH和MDA水平以評估胰島素抵抗引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。誘發(fā)IR后，抗氧化酶SOD和GSH顯著降低(P<0.01)，胞內(nèi)活性氧失衡，引起氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致MDA蓄積(P<0.01)。RGZ作為胰島素增敏劑，有一定氧化應(yīng)激保護作用，結(jié)果顯示,RGZ明顯升高IR細胞的SOD和GSH水平，同時顯著降低MDA蓄積(P<0.01)，POP孵育與RGZ有相同的作用，與IR組比較，高劑量的POP能明顯升高IR細胞的SOD和GSH水平，同時顯著降低MDA蓄積(P<0.01)，結(jié)果見表4。這可能是POP有氧化應(yīng)激損傷保護作用，拮抗IR誘發(fā)的IR作用，使得SOD和GSH維持在正常水平,從而保護保內(nèi)活性氧平衡。

2.5 POP對胰島素抵抗HepG2細胞的P13K和PPARγ蛋白表達的影響

細胞完成孵育后，棄上清取細胞提取蛋白，檢測細胞中的P13K和PPARγ蛋白表達量。與正常對照組細胞比較，IR細胞蛋白表達量都顯著降低(P<0.01)，這可能是細胞發(fā)生胰島素抵抗后，下游信號通路P13K/PPARγ被抑制，進而導(dǎo)致SOD和GSH水平下調(diào)，與IR組比較，陽性藥物RGZ和POP均能顯著提高IR細胞內(nèi)的P13K/PPARγ表達水平(P<0.05)，即激活了P13K信號通路，POP可能有胰島素素增敏作用和氧化應(yīng)激保護作用。結(jié)果見圖2。

注：A.與NC組比較， #P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。B.與NC組比較， ##P<0.01；與IR組比較， *P<0.05。圖2 玉竹多糖對胰島素抵抗HepG2細胞的PI3K/PPARγ水平的影響

3 討論

用高糖、TNF-α和胰島素等刺激HepG2細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗模型用于2型糖尿病(T2DM)研究的體外研究方法已經(jīng)應(yīng)用得十分廣泛[12-14]，IR是T2DM主要發(fā)病機制，研究表明，脂肪細胞因子失調(diào)或胰島素信號破壞均會導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)在這個過程中起十分重要的作用[15]。氧化應(yīng)激損傷也是T2DM主要并發(fā)癥之一，高糖、高脂肪酸或持續(xù)的胰島素刺激均會導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧化物(ROS)的堆積，ROS代謝產(chǎn)物——共軛二烯烴類、丙二醛(MDA)有嚴重的細胞毒性，會產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[16]。T2DM動物實驗研究表明，發(fā)生胰島素抵抗的大鼠，肝臟超氧化物歧化酶(SOD)和總谷胱甘肽(GSH)均會顯著降低，而代謝產(chǎn)物MDA會蓄積更多[17]。李蘭芳等研究證實，TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生IR的HepG2細胞經(jīng)吡格列酮孵育后，模型組的ROS水平顯著降低，可見,吡格列酮能通過改善氧化應(yīng)激損傷抑制JNK信號通路[18]。實際上，ROS與IR之間的分子關(guān)聯(lián)十分復(fù)雜，蛋白激酶C(PKC)通路和炎癥信號轉(zhuǎn)道通路(NF-κB)等也均與OS-IR形成有關(guān)[19-20]，在胰島素信號調(diào)控下游，胰島素和受體結(jié)合后經(jīng)胰島素受體底物-1(IRS-1)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)傳導(dǎo)信號，因此在改善PI3-K胰島素抵抗發(fā)生中起重要樞紐作用。RGZ作為胰島素增敏劑，增敏機制被報道與特異性過氧化物酶體增殖因子激活劑的γ型受體(PPARγ)有關(guān)，在大鼠胰島素抵抗模型中，RGZ能使IR模型大鼠血清SOD顯著升高，MDA顯著降低[21]。綜上所述，本次研究采用胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生IR-HepG2細胞模型作為研究模型是可行的。而筆者研究結(jié)果表明，IR細胞中發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，與正常對照組比較，模型組中SOD和GSH水平增加，MDA顯著降低，且RGZ可有效改善這種氧化應(yīng)激損傷?？梢?此模型可以用于研究POP的降血糖作用。

近年來,POP的分離純化及生物活性分析已成為玉竹藥理活性研究的重點，Chen Yi等分離得到精制POP并在體外研究中表明其有抗氧化活性[22]，Huiyan Jiang等從玉竹分離純化后得到分子量約3 500 KD的純化多糖YZ-2，并在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型上證實POP能降低模型小鼠的空腹血糖含量并能促進其胰島素釋放，POP能顯著改善模型小鼠肝臟組織中的SOD、CAT和GSH水平[23]。

本實驗研究結(jié)果表明，體外細胞孵育時，0.01～10 mg/mL POP對HepG2細胞生長沒有影響，且POP可有效改善對于H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷，與模型組比較，POP給藥組細胞存活率顯著升高。且10 mg/mL濃度的細胞保護作用優(yōu)于1 mg/mL濃度，1～10 mg/mL POP濃度都能有效改善胰島素抵抗，促進模型細胞的葡萄糖攝取，POP會顯著升高模型細胞中的的SOD和GSH水平，同時顯著降低細胞中的MDA濃度， MDA濃度降低是POP改善氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明，IR細胞中PIK3蛋白水平顯著降低，PPARγ表達降低，POP通過激活PIK3通路，改善胰島素抵抗，進一步激活下游PPARγ的蛋白表達。10 mg/mL POP可以達到陽性對照藥物RGZ的顯著效果。綜上所述，本研究進一步用體外細胞實驗法證實了玉竹中的多糖有基于改善氧化應(yīng)激損傷而緩解胰島素抵抗的作用，其分子機制可能是通過激活PIK3通路而發(fā)揮胰島素增敏的效應(yīng)。