小麥酯酶在快速測定有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用研究

陸正清 王海平 歐盛生 張迪雅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223005）

0 引言

果蔬農(nóng)藥殘留檢測方法有色譜法、光譜法、和快速檢測法。色譜法和光譜法能夠既定性又定量地對樣品中農(nóng)藥殘留進行檢測，但所用設(shè)備昂貴，檢測時間長，經(jīng)常存在檢測結(jié)果未出，果蔬可能早已銷售甚至已被食用，即便再檢測出農(nóng)藥殘留超標也無濟于事。因此，根據(jù)我國果蔬生產(chǎn)和銷售的特點，推廣一種在田間便可進行快速的、準確的檢測方法，對防止農(nóng)殘超標的農(nóng)產(chǎn)品進入交易市場具有重大意義。

酶抑制率法檢測農(nóng)殘具有快速、簡單、成本低等優(yōu)點，因此，此方法已被列入國家標準。標準中所用酶試劑主要為膽堿酯酶，其來源主要為動物及昆蟲體內(nèi)提取，提取步驟煩瑣，成本較高。有研究表明，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥也可抑制植物酯酶的活性，因此，也可作為快檢酶試劑。本試驗采用從價格低廉的小麥中提取小麥酯酶，進行農(nóng)殘快檢的檢測條件研究，以期得到一種能代替膽堿酯酶的農(nóng)殘快檢的酶試劑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小麥和青菜均為淮安市場購買。乙酰膽堿脂酶、固蘭B鹽、無水乙醇、а-乙酸萘酯、硫代乙酰膽堿、氨基甲酸類農(nóng)藥標準品，甲基對硫磷、樂果、敵敵畏等均為分析純。

1.2 主要儀器

農(nóng)藥殘留快檢儀（廈門斯坦道科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 酶抑制率法測農(nóng)殘

膽堿酯酶抑制率法根據(jù)GB/T5009.199-2003。小麥脂酶抑制率法測定方法如下：取1.0 ml小麥酯酶提取液于試管中，加入4.0 ml樣品測定液、0.1 mL顯色劑和4.0 mL pH為6.5的緩沖液，于30℃反應(yīng)15 min，然后加入底物а-乙酸萘酯0.5 mL，立即放入比色池，記錄吸光度變化值。

1.3.2 小麥酯酶的提取

經(jīng)過加工的小麥粉，加入5倍量的蒸餾水，以9000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，取上清液備用。

1.3.3 重復(fù)性、通道一致性、穩(wěn)定性試驗

重復(fù)性試驗：以市售青菜為檢測對象，小麥酯酶為酶制劑，連續(xù)檢測10次，計算相對標準偏差（RSD），檢測儀RSD應(yīng)小于等于1.0%。

通道一致性試驗：以質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的甲基對硫磷為標準溶液，連續(xù)試驗3次，計算每個通道的抑制率，計算各通道平均值及全部通道最大值與最小值的差值。儀器參考值在10%范圍內(nèi)。

穩(wěn)定性試驗：以蒸餾水做對照，檢測液為試驗對象，20 min內(nèi)，每隔5 min測量蒸餾水和檢測液的吸光度，取每通道變化量的最大值，以蒸餾水吸光度變化值在0.005范圍內(nèi)為宜。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶對農(nóng)藥的抑制率測定試驗

利用乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶為酶試劑，在各自最適合酶活條件下，用農(nóng)殘快速檢測儀測定2種酶試劑對質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/L樂果、0.2 mg/L敵敵畏、1.0 mg/L的甲基對硫磷、0.02 mg/L滅多威、0.04 mg/L克百威的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥酯酶最適反應(yīng)pH的確定

考察pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5條件下，小麥脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力，pH與酶活力關(guān)系如圖1所示。

圖1 pH對小麥酯酶活性的影響

由圖1可知，小麥酯酶反應(yīng)的最適pH在6.5左右，當pH低于5.5或高于7.5時，酶活力明顯降低，因此，使用酶抑制率法測定農(nóng)殘時，若采用小麥脂酶為酶制劑，應(yīng)配制緩沖液的pH為6.5。

2.2 小麥酯酶最適反應(yīng)溫度的確定

考察反應(yīng)溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下，小麥脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力，反應(yīng)溫度與酶活力關(guān)系如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度對小麥酯酶活性的影響

由圖2可知，小麥酯酶反應(yīng)的最適溫度在30℃左右，當溫度低于20℃或高于40℃時，酶活力明顯降低，因此，使用酶抑制率法測定農(nóng)殘時，若采用小麥酯酶為酶制劑，反應(yīng)溫度應(yīng)設(shè)置為30℃。

2.3 重復(fù)性、一致性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果

在最適pH和最適反應(yīng)溫度條件下，以小麥酯酶為酶試劑，采用酶抑制率法測定農(nóng)殘時，測試結(jié)果如表1所示。

表1 農(nóng)殘快檢儀測試結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)顯示，農(nóng)殘快檢儀測定10次青菜樣品的相對標準偏差為0.16%，遠低于儀器規(guī)定的參考值1.0%，說明以小麥酯酶為酶試劑時，快檢儀的重復(fù)性好。利用快檢儀對甲基對硫磷的各通道測定抑制率，結(jié)果顯示通道差為4.9%，在儀器要求的10%范圍內(nèi)，說明以小麥酯酶為酶試劑時對各通道的檢測結(jié)果無影響。20 min內(nèi)每隔5 min的吸光度變化最大值為0.002，在0.005范圍內(nèi)，說明以小麥酯酶為酶試劑時，快檢儀的穩(wěn)定性較好。

2.4 不同酶試劑對農(nóng)藥的抑制率的影響

由表2可知，以小麥酯酶為快速檢測農(nóng)殘的酶試劑時，在小麥酯酶的最適酶活條件時，其對農(nóng)藥殘留的抑制效果等同甚至優(yōu)于乙酰膽堿脂酶對農(nóng)藥的抑制效果，說明小麥酯酶可以作為農(nóng)殘快速測定時乙酰膽堿脂酶的替代物。

表2 乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶對農(nóng)藥的抑制率結(jié)果

3 結(jié)語

采用酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留時，以小麥酯酶替代乙酰膽堿酯酶時，小麥酯酶活性最適條件為pH=6.5，溫度30℃，最適酶活條件下，小麥酯酶酶抑制率法測定的重復(fù)性、通道一致性和穩(wěn)定性都較好，并且抑制率測定結(jié)果與膽堿脂酶法的結(jié)果差異不大，說明小麥酯酶可以代替乙酰膽堿脂酶對果蔬中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行測定。