栽培三七內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)種群分離鑒定

李維蛟，任 可，浦仕彪

（1云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明650500；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715）

0 引言

栽培三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]亦稱“田三七”、“山漆”、“田漆”，為五加科人參屬多年生草本植物。它始載于《本草綱目》，被譽(yù)為血癥良藥、傷科要藥。栽培三七已被國(guó)家列為貴重藥材，《中國(guó)醫(yī)藥大辭典》[1]和《中華人民共和國(guó)藥典》[2]等文獻(xiàn)書(shū)籍中都對(duì)栽培三七作了充分的肯定性的記載，有“金不換”、“南國(guó)神草”等美譽(yù)[3]。栽培三七為云南道地藥材[4]。對(duì)于栽培三七內(nèi)生真菌的研究比較豐富的主要是文三地區(qū)，許多研究工作者對(duì)栽培三七內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離并通過(guò)18S-ITS-28S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果從根、莖、葉組織中分離得到158株形態(tài)各異的內(nèi)生真菌。對(duì)其中92株的ITS序列分析顯示，91株分屬于19個(gè)已知屬，另1株真菌的ITS序列與GenBank中已報(bào)道的序列最高相似性為82%，認(rèn)為是一新種，得出栽培三七內(nèi)生菌多樣性豐富，同時(shí)不同部位內(nèi)生菌的數(shù)量、種類(lèi)及分布存在差異[5]，還有科研工作者開(kāi)展了從栽培三七內(nèi)生真菌對(duì)病原菌的抑制作用或者其生物活性研究[6-7]。

近年來(lái)對(duì)于栽培三七的需求量不斷增加，其種植面積不斷擴(kuò)大。但是由于栽培三七受到嚴(yán)重的連作障礙影響，而導(dǎo)致栽培三七連作障礙的一個(gè)主要原因就是病害。其中以根腐病最為突出，這是一種嚴(yán)重的土傳病害，栽培三七因根腐病害的常年損失達(dá)5%～20%，嚴(yán)重的達(dá)70%，所造成的損失占各種栽培三七病害的70%～85%，成為制約栽培三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重要屏障，而導(dǎo)致栽培三七根腐病的主要病原真菌是毀壞柱孢霉(Cylindrocarpon destructans)[8]和三七根腐病尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)[9-11]。

云南是目前公認(rèn)的栽培三七道地藥材的主產(chǎn)區(qū)，占栽培三七年產(chǎn)量的95%。近些年研究發(fā)現(xiàn)，從藥用植物中分離出的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生和宿主植株相同或者相似的生物活性物質(zhì)。通過(guò)分離和篩選得到活性內(nèi)生真菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后非常方便的獲得大量的活性生物成分，這為解決傳統(tǒng)中藥材短缺的現(xiàn)狀提供了一種非常理想的方案，為內(nèi)生真菌資源的開(kāi)發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)栽培三七各組織的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離、鑒定和多樣性分析，為栽培三七內(nèi)生真菌資源開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)根、莖、葉采于云南省曲靖市師宗縣，植株年齡為三年。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 將剛移栽的新鮮栽培三七的須根、主根、莖、葉分別剪下，用自來(lái)水沖洗干凈泥土。將其轉(zhuǎn)移至已經(jīng)紫外燈消毒15 min的超凈工作臺(tái)中（ZHJH-C1209B超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器有限公司）。用75%乙醇對(duì)雙手進(jìn)行消毒處理。分別對(duì)不同組織進(jìn)行消毒。75%乙醇浸泡須根30 s，主根50 s，莖40 s，葉30 s。0.1%升汞浸泡須根4 min，主根15 min，莖5 min，葉3 min。分別用無(wú)菌水沖洗3次，備用。將浸泡過(guò)無(wú)水乙醇的鑷子和手術(shù)剪置于酒精燈上灼燒，冷卻備用。取出高溫滅菌過(guò)的空培養(yǎng)皿置于酒精燈外焰范圍內(nèi)，用冷卻的鑷子分別夾取須根、主根、莖、葉，使其全面與凝固的培養(yǎng)基接觸后取出，以完成空白對(duì)照。用手術(shù)剪將須根、主根、莖、葉剪成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊。分別接種于培養(yǎng)基上，每一部位接種20皿。用記號(hào)筆標(biāo)號(hào)記號(hào)，用保鮮袋包好后放置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。待材料周?chē)L(zhǎng)出菌絲后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上。雙手消毒，點(diǎn)燃酒精燈，將解剖針置于火焰上灼燒至通紅，挖取菌落邊緣帶有少量菌絲的瓊脂塊，迅速轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上，做好標(biāo)記，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 內(nèi)生真菌的保存 內(nèi)生真菌采用石蠟油和濾紙片2種方法保存。將石蠟油于121℃下保溫2 h，菌株在斜面試管中培養(yǎng)一段時(shí)間后，上面倒入一層石蠟油，加入石蠟油的量應(yīng)超過(guò)斜面頂部1 cm，于4℃下保存。濾紙片法保存的步驟為：先用打孔器把濾紙打成小圓片，滅菌，放入培養(yǎng)皿中，同時(shí)在培養(yǎng)皿中接種真菌，等菌絲長(zhǎng)滿之后取出含有菌絲的濾紙片，放入無(wú)菌的錫箔紙中，于-20℃下保存。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察 參照戴芳瀾《中國(guó)真菌總匯》所述對(duì)所分離到的真菌進(jìn)行鑒定[12]。將分離到的代表性內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)觀察，主要觀察菌落在平板上的生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中。在顯微鏡下觀察菌絲的粗細(xì)，分生孢子器的著生部位、形狀、類(lèi)型、大小、產(chǎn)孢方式，以及分生孢子的出芽方式、是否有隔、大小、形狀、表面特征、色澤等形態(tài)特征。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用CTBA法提取真菌基因組DNA。ITS擴(kuò)增使用的引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，兩者為通用引物，由昆明擎科生物有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系為：10 μL 10×PCR Buffer，0.25 μL dNTPs(10 mmol/L)，1 μL ITS4，1 μL ITS5，0.3 μL Taq酶，1 μL DNA模板，用ddH2O補(bǔ)足 50 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 4 min，94℃ 1 min，54℃1 min，72℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)，72℃ 3 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物由昆明擎科生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Chromas軟件校對(duì)，以每個(gè)形態(tài)型菌株的ITS序列作為靶序列，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast搜索，將相似度最高的序列作為參考序列，并用于系統(tǒng)發(fā)育分析和鑒定。確定序列的有效性；打開(kāi)序列文件并復(fù)制該序列；打開(kāi)NCBI網(wǎng)站，進(jìn)入BLAST功能區(qū)域選擇Nucleotide BLAST；粘貼序列于序列框，輸入序列編號(hào)，勾選“show results in a window”；點(diǎn)擊BLAST；根據(jù)ident（百分比）確定所測(cè)樣品序列的分類(lèi)地位。RensKe Landeweer等[13]認(rèn)為通過(guò)ITS區(qū)域比對(duì)，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬，序列相似性小于95%，鑒別為相同科。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

從栽培三七不同部位中分離出的內(nèi)生真菌種類(lèi)有差異，并且分布頻率不盡相同。從葉片上分離出內(nèi)生真菌11株，占總共分離出內(nèi)生真菌的45.83%，其中以3號(hào)和6號(hào)菌種為優(yōu)勢(shì)菌，均葉片分離菌種的27.28%；莖部分離出內(nèi)生真菌1株，占總共分離出內(nèi)生真菌的4.17%；主根分離出內(nèi)生真菌1株，占總共分離出內(nèi)生真菌的4.17%；須根分離出內(nèi)生真菌11株，占總共分離出內(nèi)生真菌的45.83%，其中以9號(hào)菌種為優(yōu)勢(shì)菌種，占須根分離菌種的72.73%。由此可見(jiàn)，栽培三七的葉、莖、主根和須根內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布和優(yōu)勢(shì)種群方面有差異，這表明栽培三七內(nèi)生真菌數(shù)量和種群的多樣性特點(diǎn)。

2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)菌落生長(zhǎng)速率、形態(tài)、顏色，以及菌絲、產(chǎn)孢器、孢子梗、分生孢子等顯微形態(tài)特征，將內(nèi)生真菌劃分為12類(lèi)，每1類(lèi)中選取1株具有代表性的菌株進(jìn)行觀察，共12株，編號(hào)分別為1～12，代號(hào)分別為A～J。

對(duì)分離出的24株內(nèi)生真菌進(jìn)行了DNA提取和PCR擴(kuò)增，根據(jù)ITS序列與GenBank中的序列同源性關(guān)系，將所得菌種歸類(lèi)為12個(gè)屬（種）（表2）。從種屬歸類(lèi)可見(jiàn)栽培三七內(nèi)生真菌種類(lèi)多樣性豐富。其中葉片中的優(yōu)勢(shì)菌種為3號(hào)普通青霉菌(Penicillium commune)和6號(hào)菌膠孢刺盤(pán)孢菌(Colletotrichum gloeosporioides)，須根中的優(yōu)勢(shì)菌為9號(hào)球毛殼菌(Chaetomidiumarxii)均是分離株數(shù)較高，數(shù)量較大的優(yōu)勢(shì)菌種。至于莖中只分離出來(lái)7號(hào)球殼菌(Chaetomiumfunicola)，主根中分離出來(lái)8號(hào)菌孢鐮孢菌(Fusarium redolens)。說(shuō)明內(nèi)生菌普遍存在于栽培三七的葉和根中。

表1 栽培三七不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量與種類(lèi)分布

表2 栽培三七內(nèi)生真菌種類(lèi)及菌落形態(tài)特征

對(duì)葉片中分離出的優(yōu)勢(shì)菌3號(hào)和6號(hào)進(jìn)行鑒定：其中3號(hào)菌菌落生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)地細(xì)膩，邊緣呈淡褐綠色。正面顏色為深褐綠色，背面顏色為黃綠色，中央有灰色凸起（圖1-C、圖1-F）。將該真菌的ITS全序列（圖2）提交到GenBank核酸序列庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定3號(hào)菌株為普通青霉菌(Penicilliumcommune)。

圖1 內(nèi)生真菌PDA培養(yǎng)菌落生長(zhǎng)圖

圖2 三號(hào)菌株ITS全序列

其中6號(hào)菌菌落生長(zhǎng)迅速，質(zhì)地細(xì)膩，菌落正反面均呈現(xiàn)乳白色，菌絲密集。將該真菌的ITS全序列（圖3）提交到GenBank核酸序列庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定6號(hào)菌株為膠孢刺盤(pán)孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

圖3 六號(hào)菌株ITS全序列

對(duì)須根中分離出的優(yōu)勢(shì)菌9號(hào)進(jìn)行鑒定：9號(hào)菌的菌落形態(tài)特征如圖1-I所示。其中9號(hào)菌菌落生長(zhǎng)迅速，菌絲呈墨綠色，周?chē)喾植己谏驙罹耍溥吘壋实S綠色。正面顏色為墨綠色，背面顏色為黃綠色。將該真菌的ITS全序列（圖4）提交到GenBank核酸序列庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定9號(hào)菌株為球毛殼菌(Chaetomidiumarxii)。

圖4 九號(hào)菌株ITS全序列

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)栽培三七內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離、鑒定。由于分離栽培三七的各部位數(shù)量、分離手段的限制，推測(cè)該植物中還有許多內(nèi)生真菌尚未被分離出來(lái)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)合前人的研究成果，初步推斷出植物內(nèi)生真菌幾乎存在于所有的植物中，且絕大多數(shù)內(nèi)生真菌還沒(méi)有被研究，因此深入挖掘植物內(nèi)生真菌中生物活性物質(zhì)，在農(nóng)藥、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景[14-17]。

栽培三七內(nèi)生真菌種類(lèi)較多，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，可以開(kāi)發(fā)其潛在的價(jià)值。對(duì)于栽培三七內(nèi)生菌和其病原菌的研究已有結(jié)果表明從栽培三七內(nèi)生真菌中可以篩選出對(duì)栽培三七根腐病主要原真茵具有良好抑制作用的菌種。所以重點(diǎn)可以放在對(duì)栽培三七病害的控制方面，比如根腐病的主要病原真菌是毀壞柱孢菌和栽培三七尖孢鐮刀菌，可以對(duì)栽培三七內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，然后進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)，篩選出具有對(duì)該病菌有強(qiáng)烈抑制性的內(nèi)生真菌[17-18]。

此外，栽培三七內(nèi)生真菌中有些常見(jiàn)菌種，可以作為生防菌種，值得研究開(kāi)發(fā)防治植物病害方面。有文獻(xiàn)顯示，毛殼菌屬真菌不僅在栽培三七中出現(xiàn)，而且廣布于自然界[19-20]，是一種可以用于防治多種作物、林木的真菌。還有些能產(chǎn)生紫杉醇例如多節(jié)孢屬的真菌[21]，這種萜類(lèi)生物堿對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞具有非常好的活性。眾所周知，紫杉醇從1963年被發(fā)現(xiàn)到用于臨床研究抗腫瘤活性以來(lái)[22]，其來(lái)源植物紅豆杉種群不斷受到嚴(yán)重破壞，這樣的發(fā)現(xiàn)無(wú)異于是找到了另一種途徑得到紫杉醇，非常值得研究。

在進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于操作不當(dāng)會(huì)引入細(xì)菌和真菌，當(dāng)這些外來(lái)的菌種著生在已經(jīng)長(zhǎng)有內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基上時(shí)，這些外來(lái)菌很多都會(huì)被抑制，這一發(fā)現(xiàn)可為將來(lái)開(kāi)發(fā)研究栽培三七內(nèi)生真菌抗菌活性成分提供依據(jù)。還有些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生綠色能源[23]，這是一種非常環(huán)保的能源動(dòng)力，在這個(gè)倡導(dǎo)低碳節(jié)能的社會(huì)，這種能源將會(huì)是研究的熱點(diǎn)。所以，從栽培三七內(nèi)部可以找到許多值得開(kāi)發(fā)研究的內(nèi)生真菌，尤其是研究其病害控制方面，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）依據(jù)《中國(guó)真菌總匯》所述對(duì)所分離到的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述和鑒定，對(duì)24株真菌獲得的序列與已有NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)分析，得到炭角菌屬(Xylariaceaesp.)1株、鏈格孢菌(Alternariaalternate)2株、普通青霉菌(Penicilliumcommune)3株、擔(dān)子菌(Bjerkanderaadusta)2株、柄孢殼屬(Podosporasp.)1株、膠孢刺盤(pán)孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)3株、繩生毛殼菌(Chaetomiumfunicola)1株、芳香鐮孢菌(Fusariumredolens)1株、球毛殼菌(Chaetomidium arxii)8株、梭孢殼屬(Thielaviasp.)1株及金黃毛殼菌(Chaetomiumaureum)1株。

（2）對(duì)栽培三七寄生真菌分離所得的菌落分析所知，普通青霉菌(P.commune)、膠孢刺盤(pán)孢菌(C.gloeosporioides)及球毛殼菌(C.arxii)為優(yōu)勢(shì)種群。