nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答的研究進(jìn)展

馬 悅，于 冰

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

0 引言

由nsLTPs基因編碼的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTPs)具有促進(jìn)磷脂在細(xì)胞膜間轉(zhuǎn)移的能力并因此命名[1-2]。nsLTPs在植物界廣泛分布，屬于醇溶蛋白超家族[3]，具有促進(jìn)兩親分子在細(xì)胞膜間交換和轉(zhuǎn)移的能力，兩親分子指既具有親水性、又具有親脂性的分子，例如：磷脂、糖脂、類固醇、?；o酶A和脂肪酸等[4]。

nsLTPs在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，主要參與植物種子萌發(fā)、角質(zhì)層蠟形成[5]、表皮細(xì)胞毛狀體形成[6]、細(xì)胞壁延伸過程[7]，同時(shí)參與調(diào)控根瘤共生[8]、植物激素反應(yīng)和光合作用等過程[9]。隨著對nsLTPs功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)nsLTPs在植物生物及非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，但是對于此方面的研究缺乏全面的梳理，鮮有綜述報(bào)道。本文主要闡述了植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白nsLTPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、亞細(xì)胞定位及分類，并結(jié)合近年來的研究報(bào)道，重點(diǎn)介紹了nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答的最新研究進(jìn)展，總結(jié)了植物不同物種中nsLTPs基因響應(yīng)生物脅迫、非生物脅迫的調(diào)控途徑，以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研人員提供借鑒和參考。

1 nsLTPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、亞細(xì)胞定位及分類

1.1 nsLTPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及亞細(xì)胞定位

nsLTPs相對分子量較小，一般為7k～10kDa[10]，等電點(diǎn)8.8～10，是一種小肽[11]，每個小肽中含有8個高度保守的半胱氨酸殘基骨架，其一般形式為C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C[12]。除此之外，nsLTPs的N端具有疏水信號肽，是引導(dǎo)新合成的nsLTPs蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈[13]。nsLTPs靠近C端具有鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合位點(diǎn)[14]，CaM結(jié)合位點(diǎn)可以調(diào)節(jié)nsLTPs與 Ca2+的相互作用[15]。

nsLTPs的8個半胱氨酸殘基通過4個二硫鍵進(jìn)行結(jié)合[16]，可以將nsLTPs折疊成一個非常緊湊的結(jié)構(gòu)——含有內(nèi)疏水腔的三維結(jié)構(gòu)[17]，賦予了nsLTPs熱穩(wěn)定性和蛋白水解抗性[18]。該疏水腔充當(dāng)脂類和其他疏水分子的結(jié)合位點(diǎn)[19]；疏水腔能夠在脂質(zhì)雙層之間轉(zhuǎn)移各種脂質(zhì)分子，能夠容納許多不同的配體，如：脂肪酸、脂肪?；o酶A、磷脂、糖脂和羥基化脂肪酸[20]。

Anthony等[21-23]對甘藍(lán)型油菜(BrassicarapaL.)中的BrLTP2.1蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測，BrLTP2.1蛋白全長為98個氨基酸，使用i-TASSER軟件對不帶N端信號肽的BrLTP2.1成熟氨基酸序列進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模，預(yù)測結(jié)果顯示，與大多數(shù)nsLTPs一樣，BrLTP2.1具有由8個半胱氨酸殘基形成的4個α螺旋和4個二硫鍵（圖1），紅色為4個α螺旋（從N端到C端標(biāo)記為H1～H4）、黃色為4個二硫鍵；基于其三級結(jié)構(gòu)，預(yù)測了BrLTP2.1與脂質(zhì)LP3（1-硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿）結(jié)合的疏水腔（圖2）[23]。

圖1 BrLTP2.1的結(jié)構(gòu)建模

圖2 BrLTP2.1與脂質(zhì)LP3結(jié)合

不同nsLTPs在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位不同，可以定位在質(zhì)膜[23]、細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)中[24]。

1.2 nsLTPs的分類

根據(jù)分子質(zhì)量，nsLTPs分為兩種亞家族，分別是nsLTPⅠ和nsLTPⅡ亞家族[25]。LTPⅠ亞家族成員分子質(zhì)量約為9k～10kDa，N端是長約21～27個氨基酸的疏水信號肽序列。LTPⅡ亞家族成員的大小約為7 kDa，N端是27～35個氨基酸組成的疏水信號肽序列[26]。LTPⅠ與LTPⅡ的疏水腔結(jié)構(gòu)不同[27]，LTPⅠ亞家族成員具有隧道狀疏水腔，LTPⅡ亞家族成員有2個相鄰的疏水腔并且可塑性更大，因此脂轉(zhuǎn)移活性更大[28]。LTPⅡ亞家族成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有更高的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力[29]。LTPⅠ與LTPⅡ形成二硫鍵的配對方式不同，LTPⅠ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-6、2-3、4-7和5-8，LTPⅡ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-5、2-3、4-7和6-8[25]。

2011年，Edstam等[30]基于序列相似性、糖基磷脂酰肌醇(GPI)修飾位點(diǎn)、內(nèi)含子位置和半胱氨酸殘基之間的間隔，又提出了一種nsLTPs的新的分類方式。該種分類方式保留了根據(jù)分子質(zhì)量建立的LTPⅠ和LTPⅡ亞家族分類方式，另外建立了C，D，E，F(xiàn)，G，H，J和K型亞家族分類方式。具體分類見表1[18]，其中C代表nsLTPs中保守的半胱氨酸，X代表任意氨基酸，X的下角標(biāo)數(shù)字代表氨基酸個數(shù)。

表1 nsLTPs的I、Ⅱ亞家族及C-K亞家族分類方式

2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答研究

在植物的生長過程中，植物會受到各種逆境脅迫的影響，包括生物脅迫和非生物脅迫，這些脅迫是植物的生存與發(fā)育過程中的不利因素，進(jìn)一步會衍生出糧食減產(chǎn)以及品質(zhì)下降等問題[3]。近年來，關(guān)于通過反向遺傳學(xué)技術(shù)研究nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答研究報(bào)道較多，本文總結(jié)了近年來在不同植物中nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答的相關(guān)研究[19-29]，見表2。以下分別對nsLTPs基因參與植物生物脅迫應(yīng)答和非生物脅迫應(yīng)答功能及調(diào)控途徑進(jìn)行具體介紹。

2.1 nsLTPs基因參與植物生物脅迫應(yīng)答研究

植物nsLTP基因在植物抵抗細(xì)菌和真菌侵襲的保護(hù)中起著關(guān)鍵作用[42]，目前在甘藍(lán)型油菜(Brassica rapaL.)、大麥(HordeumvulgareL.)、胡椒(Piper nigrumL)、煙草(NicotianatabacumL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)中進(jìn)行了nsLTP基因參與生物脅迫應(yīng)答功能研究[43]，表明nsLTP基因可以增強(qiáng)植物對真菌和細(xì)菌病原體的抗菌性，提高植物的抗病性[31-41]（表2）。

表2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應(yīng)答研究

續(xù)表2

nsLTPs具有抗菌性能[44]，是與病程相關(guān)的蛋白[32]，參與植物防御機(jī)制[45]。2018年，徐揚(yáng)等[46]研究表明煙草中的NtLTPs能夠通過參與抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而提高植物的抗病性。NtLTPs是一種病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein,PR protein)，青枯菌(Ralstoniasolanacearum)侵染煙草后，NtLTP4能夠通過增強(qiáng)活性氧的清除和降低氣孔開度來提高轉(zhuǎn)基因煙草對青枯菌的抗性。MAPK級聯(lián)信號通路在植物響應(yīng)生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用，創(chuàng)傷誘導(dǎo)蛋白激酶(Wound-induced protein kinase，WIPK)是 MAPK家族成員之一[3]。通過MAPK級聯(lián)信號通路NtNPK1-NtMEK2-NtWIPK進(jìn)行信號傳遞，進(jìn)一步繼續(xù)將信號傳遞給位于NtWIPK下游的NtLTP4，NtLTP4與NtWIPK存在互作關(guān)系，通過增強(qiáng)NtLTP4蛋白的穩(wěn)定性來參與抗病防御過程，從而提高了煙草對的青枯病的抗病性[46]（圖3A）。

2.2 nsLTPs基因參與植物非生物脅迫應(yīng)答研究

nsLTPs基因參與非生物脅迫應(yīng)答有助于植物適應(yīng)環(huán)境條件的變化[40]。nsLTPs家族成員能夠響應(yīng)一種或多種非生物脅迫[3]，包括干旱、低溫、高溫、鹽堿、滲透脅迫、過氧化氫、重金屬脅迫等。nsLTPs還顯示出對非生物脅迫相關(guān)植物激素的應(yīng)答反應(yīng)，包括脫落酸(ABA)，水楊酸，茉莉酸甲酯和乙烯利等。

在植物中，已經(jīng)報(bào)道nsLTPs基因受到多種非生物脅迫或植物激素的誘導(dǎo)表達(dá)。潘那利番茄(Lycopersiconpennellii)中的LpLtp1和LpLtp2基因受到干旱誘導(dǎo)表達(dá)[41]。無芒雀麥(Bromusinermis)中的BG-14基因在干旱、冷和熱等非生物脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)[39]。擬南芥中的LTP基因AtAZI1受到低溫、鹽脅迫以及乙烯誘導(dǎo)表達(dá)[35]。一種從冷脅迫的卷心菜葉中分離的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白同源物：冷凍保護(hù)素，可保護(hù)分離的葉綠體類囊體膜免受凍融損害[47]。目前在甘藍(lán)型油菜(BrassicarapaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、玉米 (ZeamaysL.)水稻(OryzasativaL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、胡椒(PipernigrumL.)等植物中進(jìn)行了nsLTP基因參與非生物脅迫應(yīng)答功能研究，表明nsLTP基因可以增強(qiáng)植物對高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫抗逆性（表2）。

對于nsLTPs參與植物非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控途徑只有少量相關(guān)報(bào)道；有報(bào)道顯示nsLTPs受上游蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、激酶或磷酸酶）調(diào)節(jié)[48]。

徐揚(yáng)等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，NtLTP4過表達(dá)煙草中，NHX1和HKT1兩個關(guān)鍵的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量明顯高于野生型；研究表明NtLTP4能夠通過調(diào)控NHX1和HKT1促進(jìn)Na+向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)以及Na+由地上向地下運(yùn)輸這2個過程，增強(qiáng)煙草對Na+的清除，減弱了Na+對植物細(xì)胞的毒害作用，從而提高鹽脅迫的耐受性（圖3B），并通過降低蒸騰速率和氣孔開度增強(qiáng)對干早脅迫的耐受性[46]。

Guo等[49]研究發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)體系純化的擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)AtLTP3蛋白在體外能夠與脂類結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子AtMYB96通過直接和AtLTP3基因啟動子的直接結(jié)合，正調(diào)節(jié)AtLTP3蛋白參與植物對低溫和干旱脅迫的耐受能力（圖3C）。AtLTP3可以結(jié)合脂質(zhì)并將其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上，形成角質(zhì)層蠟，從而保護(hù)植物免受和干旱脅迫的侵害。

Pitzschkea等[35]研究發(fā)現(xiàn)，AZI1是一種富含脯氨酸的nsLTPs蛋白質(zhì)，是有絲分裂活化蛋白激酶3(MAPK3)的互作蛋白。在擬南芥中過表達(dá)AtAZI1基因，能夠加強(qiáng)AtAZI1與AtMAPK3互作，AtMAPK3將AtAZI1磷酸化后使其激活，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力明顯增強(qiáng)（圖3D）。

潘燕林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，粟(SetariaitalicaL.)SiLTP基因的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草和小米的抗鹽和抗旱能力。李聰?shù)萚50]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用的SiARDP參與了ABA依賴的信號途徑，SiARDP轉(zhuǎn)錄因子可以與SiLTP基因啟動子區(qū)域的DRE元件結(jié)合并激活SiARDP的表達(dá)，進(jìn)而激活SiARDP的靶基因，表達(dá)SiARDP基因可以使SiLTP基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，說明SiARDP轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)SiLTP基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽和抗旱能力（圖3E）。

圖3 nsLTP基因參與生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答的初步分子調(diào)控模式圖

3 展望

隨著研究的不斷深入，有關(guān)植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTPs)的研究被越來越廣泛關(guān)注，但是對于植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTPs)的功能研究仍存在問題。未來的研究方向：（1）在不同物種中，植物nsLTPs在響應(yīng)逆境脅迫時(shí)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需要進(jìn)一步研究。（2）植物nsLTPs的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其具有熱穩(wěn)定性，并且能夠結(jié)合和運(yùn)輸脂質(zhì)，但此功能與植物響應(yīng)逆境脅迫之間的聯(lián)系仍不明確。（3）為了深入挖掘植物nsLTPs的功能，需要深入了解植物nsLTPs蛋白修飾狀態(tài)在植物逆境應(yīng)答中的作用。

綜上所述，全面闡明植物nsLTP基因在植物逆境脅迫應(yīng)答過程中的調(diào)控途徑及功能仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。隨著基因功能研究技術(shù)的不斷發(fā)展，將促進(jìn)對nsLTP基因分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面研究，為今后深入探究植物nsLTP基因應(yīng)答逆境脅迫的分子機(jī)理奠定良好基礎(chǔ)。