轉(zhuǎn)錄因子E2F1 及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立

安嬌，朱長軍，王雅潔*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

轉(zhuǎn)錄因子E2F1 最早是在研究腺病毒E2 啟動(dòng)子的過程中發(fā)現(xiàn)的[1]，是E2F家族中被研究最多的成員。研究表明，E2F1 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控各種下游關(guān)鍵靶基因的表達(dá)參與各種基本細(xì)胞生命活動(dòng)過程，是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。一方面，E2F1 參與了細(xì)胞周期從G1 期到S 期的轉(zhuǎn)換[2]；另一方面，E2F1還通過p53 依賴型以及p53 非依賴型兩種細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮促凋亡功能[3]。E2F1 在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并通過影響細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲和細(xì)胞耐藥等進(jìn)程來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。但是E2F1 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制仍不完全清楚。

在人體內(nèi)，轉(zhuǎn)錄因子E2F1 位于染色體20q11，片段長度約11 kb，編碼437 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。E2F1 主要功能域包含cyclin A 結(jié)合功能域、DNA 結(jié)合功能域、DP 結(jié)合功能域、Marked box 功能域、轉(zhuǎn)錄激活功能域和Rb 結(jié)合功能域。

本研究構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pFlag-E2F1 及其DNA 結(jié)合功能域突變體質(zhì)粒pFlag-E2F1E132，并進(jìn)一步獲得了與之對(duì)應(yīng)的穩(wěn)篩細(xì)胞株。這些細(xì)胞株對(duì)E2F1 的關(guān)鍵下游靶基因的篩選具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa 細(xì)胞和pFlag 真核細(xì)胞表達(dá)載體由天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pCMV-E2F1 表達(dá)質(zhì)粒由中國科學(xué)院水生生物研究所生物多樣性與水生生物保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，Biological Industries公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，Thermo Fisher Scientific 公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀(jì)公司；Flag 抗體、Actin 抗體、Tubulin 抗體，Sigma 公司；二抗HRP，Invitrongen 公司。

Eclipse TS100 倒置熒光顯微鏡，Nikon 公司；Steri-Cycle 直熱式Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；Mini P4 小型蛋白電泳儀，Bio-Rad 公司；5417R 小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 pFlag-E2F1 真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過查詢真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pCMV-E2F1 和真核細(xì)胞表達(dá)載體pFlag 的質(zhì)粒圖譜，酶切獲得目的片段E2F1 和載體pFlag，然后用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，得到pFlag-E2F1 重組質(zhì)粒，小提質(zhì)粒后測序。

1.2.2 Flag-E2F1 的DNA 結(jié)合功能域突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

在E2F1 DNA 結(jié)合功能域的關(guān)鍵位點(diǎn)[6]處設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。上游：5'-CACGCTATGAGACCTCAGA ATCCCTGACCACCAAGCGCTTC-3'，下游：5'-GAA GCGCTTGGTGGTCAGGGATTCTGAGGTCTCATAGCG TG-3'。以pFlag-E2F1 質(zhì)粒為模板進(jìn)行點(diǎn)突變PCR。在PCR 產(chǎn)物中加入限制性核酸酶Dpn Ⅰ，去除被甲基化的模板質(zhì)粒。小提質(zhì)粒后送往金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)篩細(xì)胞株的構(gòu)建

在24 孔板中接種宮頸癌細(xì)胞HeLa，24 h 后用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染pFlag-E2F1 和pFlag-E2F1E132質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過Western blot 檢測Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白的表達(dá)。同時(shí)，分別將對(duì)應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿，用G418（750 μg/mL）進(jìn)行篩選，挑取單克隆。通過Western blot 檢測，將能表達(dá)Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的單克隆細(xì)胞擴(kuò)增，得到穩(wěn)定表達(dá)Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白的穩(wěn)篩細(xì)胞株。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pFlag-E2F1 及其突變體質(zhì)粒pFlag-E2F1E132 的構(gòu)建

首先通過雙酶切獲得載體pFlag 和目的片段E2F1，然后用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pFlag-E2F1。經(jīng)測序鑒定，pFlag-E2F1 質(zhì)粒序列無誤。

如圖1a 所示，以pFlag-E2F1 為模板，通過點(diǎn)突變PCR 的方式將E2F1 DNA 結(jié)合功能域的第132 位亮氨酸（L）和133 位天冬酰胺（N）分別替換為谷氨酸（E）和絲氨酸（S），使其失去DNA 結(jié)合能力[6]。經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、小提質(zhì)粒后測序鑒定。如圖1b 所示，與pFlag-E2F1 序列比對(duì)，突變體質(zhì)粒pFlag-E2F1E132序列成功突變。

圖1 質(zhì)粒pFlag-E2F1 和質(zhì)粒pFlag-E2F1E132 的構(gòu)建

2.2 Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

在HeLa 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pFlag-E2F1 和pFlag-E2F1E132質(zhì)粒，48 h 后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 cm 平皿，用含有750 μg/mL G418 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取單克隆。用Western blot 和免疫熒光染色的方法進(jìn)行檢測，如圖2 所示，F(xiàn)lag-E2F1 單克隆的#6 細(xì)胞株和Flag-E2F1E132單克隆的#2 細(xì)胞株分別穩(wěn)定表達(dá)Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白且免疫熒光染色顯示這兩種蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明穩(wěn)定表達(dá)Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的細(xì)胞株構(gòu)建完成。

圖2 Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

3 結(jié)論

本課題構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pFlag-E2F1 及其突變體質(zhì)粒pFlag-E2F1E132，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的HeLa 細(xì)胞株。這些細(xì)胞株的構(gòu)建有助于進(jìn)一步通過ChIP 實(shí)驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)錄因子E2F1 下游關(guān)鍵靶基因，為深入研究E2F1在細(xì)胞不同生命活動(dòng)中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。