浙江省淳安縣中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒與蜂房球菌感染情況調(diào)查

王德前，黃敏婕，郭海坤，方勐鴿，李君竹，董捷*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.浙江省淳安千島湖方興中蜂專業(yè)合作社，杭州 311701；4.浙江省淳安千島湖好清蜜蜜蜂專業(yè)合作社，杭州 311701）

養(yǎng)蜂業(yè)是我國(guó)一項(xiàng)傳統(tǒng)的綠色產(chǎn)業(yè)，其不但通過(guò)蜜蜂為農(nóng)作物授粉帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，而且可以向社會(huì)提供豐富的蜂產(chǎn)品，幫助農(nóng)民脫貧致富。近些年來(lái)，養(yǎng)蜂業(yè)在全國(guó)各地山區(qū)精準(zhǔn)扶貧工作中發(fā)揮了突出的作用[1]。浙江省淳安縣地處浙西山地丘陵區(qū)，是新安江和千島湖交匯處，擁有著名的杭州千島湖景區(qū)。該地區(qū)溫暖濕潤(rùn)，雨量充沛，全縣森林覆蓋率達(dá)75.27%，位居全省首位，動(dòng)植物等生態(tài)資源十分豐富[2]。隨著浙江省綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的深入推進(jìn)，淳安縣中華蜜蜂（中蜂）飼養(yǎng)量呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì)。據(jù)2016 年調(diào)查，淳安縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有蜜蜂養(yǎng)殖，蜜蜂養(yǎng)殖量已達(dá)2萬(wàn)多群，產(chǎn)值3 000余萬(wàn)元。中蜂產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展不但改善了當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的收入，而且在維持生態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用[3-4]。

目前，淳安縣中蜂飼養(yǎng)量仍在持續(xù)增加，但與此同時(shí)，蜜蜂病害的發(fā)生率以及中蜂逃群現(xiàn)象也隨之增多。其中，中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病（簡(jiǎn)稱“中囊病”）是中蜂蜂群中一種嚴(yán)重的傳染病，由中蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）引起，該病害具有發(fā)病快且傳播迅速的特點(diǎn)，生產(chǎn)中如果防控不及時(shí)，可造成嚴(yán)重?fù)p失，是中蜂主要病害之一[5]。另外，由于浙江省存在意蜂回鄉(xiāng)越冬現(xiàn)象，意蜂和中蜂混養(yǎng)情況時(shí)有發(fā)生，造成蜂病交叉感染，致使中蜂患病率提高[6]。其中，歐洲幼蟲(chóng)腐臭?。ê?jiǎn)稱“歐幼病”）則是由意蜂傳染至中蜂的一種細(xì)菌病，由蜂房球菌（Melissococcus pluton）引起，該病害雖比中囊病致死率低，但生產(chǎn)中如果未采取有效防控措施，往往也會(huì)造成蜂群損失[7]?？傊?，中囊病和歐幼病是中蜂生產(chǎn)中2 種常見(jiàn)的主要病害，雖然它們的病原不同，但危害的對(duì)象均是幼蟲(chóng)。這2 種病害沒(méi)有給成年工蜂帶來(lái)明顯癥狀，但工蜂卻是這2 種幼蟲(chóng)病原的重要攜帶者和傳播者。中囊病和歐幼病均通過(guò)蜂群內(nèi)工蜂的清潔和飼喂等行為傳播給幼蟲(chóng)，從而導(dǎo)致病害在蜂群內(nèi)甚至不同蜂群和蜂場(chǎng)間傳播，引起幼蟲(chóng)感染死亡。因此，蜂群內(nèi)病原的存在和傳播是病害發(fā)生的重要因素，將工蜂作為病害流行調(diào)查對(duì)象，通過(guò)分析工蜂病原攜帶情況，也是預(yù)測(cè)這2種病害發(fā)生、發(fā)展和流行的一種方法。

近年來(lái)，關(guān)于浙江省淳安縣中蜂病害的流行調(diào)查已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。2017 年冬季，董捷等[8]對(duì)浙江省淳安縣17 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行了中囊病的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有13 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中囊病病毒檢測(cè)呈陽(yáng)性，其中有6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)病毒檢出率超過(guò)50%，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在中蜂飼養(yǎng)密集和有意蜂混養(yǎng)的地方，中囊病病毒感染比例較高。同年，郭蕊等[9]對(duì)淳安縣17 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中蜂歐幼病的流行情況也進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)毓灿?1個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的蜂群檢出蜂房球菌感染，其中5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的病原檢出率超過(guò)40%。這些研究結(jié)果表明，淳安縣大部分地區(qū)的中蜂蜂群中，中囊病和歐幼病的病原均普遍存在。這是針對(duì)該地區(qū)秋冬季節(jié)開(kāi)展的中蜂2 種主要病害流行情況的大面積普查，而這2 種病害在淳安縣中蜂蜂群的全年發(fā)生動(dòng)態(tài)情況仍然未知。因此，本研究選擇蜂群內(nèi)的工蜂作為病害調(diào)查對(duì)象，對(duì)浙江省淳安縣中蜂蜂群中由工蜂攜帶的中囊病和歐幼病的病原情況進(jìn)行了全年定期監(jiān)測(cè)，同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）方法檢測(cè)蜂群中囊病病毒載量的變化水平，從而分析浙江省淳安縣千島湖地區(qū)中蜂中2種主要病害的全年流行風(fēng)險(xiǎn)及其混合感染情況，為合理制定中蜂病害防控措施，防止中蜂病害大規(guī)模爆發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)浙江省中華蜜蜂的健康養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究選擇浙江省淳安縣千島湖地區(qū)5個(gè)中蜂定地飼養(yǎng)蜂場(chǎng)作為中蜂病原流行觀測(cè)樣品采集點(diǎn)，分別為威坪鎮(zhèn)、千島湖鎮(zhèn)、金峰鄉(xiāng)、臨岐鎮(zhèn)、宋村鄉(xiāng)。采集時(shí)間為2019 年1 月—12 月，每月1 日—5 日在每個(gè)采集點(diǎn)采樣，每個(gè)點(diǎn)采集5 群，全年共采集300群。每群采集蜂群內(nèi)50～100 頭工蜂活體，裝入帶有煉糖的蜂籠內(nèi)并帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮冷凍后置于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 主要試劑

總RNA/DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?DNA/RNA Isolation Kit R6731-01）購(gòu)自美國(guó)Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 6110A）與熒光定量PCR試劑（TB Green?Premix Ex TaqTMⅡRR820A）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、感受態(tài)細(xì)胞（Trans1-T1）、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品DNA 和RNA 的提取

在采集的樣品中每群取工蜂20頭，在液氮中研磨成混合粉末，參照DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取樣品的總DNA 和總RNA，保存于－80 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 中囊病與歐幼病檢測(cè)與分析

參考董捷等[8]報(bào)道的中囊病檢測(cè)方法，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)中囊病病毒；參考郭蕊等[9]報(bào)道的歐幼病檢測(cè)方法，利用PCR方法檢測(cè)蜂房球菌。病原檢測(cè)的引物信息見(jiàn)表1。分析檢測(cè)結(jié)果，分別對(duì)1月—12月病原調(diào)查中不同取樣點(diǎn)蜂群病原陽(yáng)性檢出數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制工蜂中中囊病和歐幼病病原檢出率的全年變化圖。

表1 中囊病病毒和歐幼病病原檢測(cè)的引物信息Table 1 Primer information used for detecting Chinese sacbrood virus(CSBV)and European foulbrood disease(EFB)pathogens

1.3.3 中囊病病毒絕對(duì)定量

根據(jù)1.3.2 節(jié)的樣品檢測(cè)結(jié)果，選擇同一時(shí)期CSBV 檢測(cè)為陽(yáng)性的蜂群，然后根據(jù)蜂房球菌檢測(cè)結(jié)果將這些CSBV 檢測(cè)呈陽(yáng)性的蜂群進(jìn)行分組，其中，未檢出蜂房球菌的為CSBV組，檢出蜂房球菌的為CSBV＋EFB組；采用RT-PCR方法對(duì)不同時(shí)期2組蜂群內(nèi)中囊病病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行分析。

參考陳功文等[10]報(bào)道的病毒絕對(duì)定量方法和步驟進(jìn)行CSBV拷貝數(shù)分析，以GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）公布的浙江省來(lái)源的CSBV-ZJ 病毒全基因組（登錄號(hào)：MH509439）為參考序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)特異性RT-qPCR引物（表1）；經(jīng)病毒質(zhì)粒梯度熒光定量PCR試驗(yàn)，建立的CSBV病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線為：yCSBV=－3.639x＋38.596，R2=0.999（y代表CT值，x代表病毒基因組拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)，病毒基因組拷貝數(shù)為10x）。根據(jù)CSBV標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算出細(xì)菌病毒混合感染和單一病毒感染蜂群樣品中CSBV 病毒的拷貝數(shù)；利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 對(duì)樣品間的差異情況進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江省淳安縣中囊病病毒全年流行規(guī)律

為調(diào)查浙江省淳安縣中囊病病毒流行規(guī)律，對(duì)該地區(qū)的5 個(gè)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行了12 個(gè)月的定點(diǎn)取樣。結(jié)果（圖1）顯示：從一年的越冬結(jié)束至春繁開(kāi)始時(shí)，3月的蜂群內(nèi)CSBV的感染率最高，為84%，隨后逐漸降低，直到7 月病毒感染率降到最低，為12%，然后隨著秋繁開(kāi)始，CSBV 的感染率開(kāi)始升高，一直延續(xù)到冬季。

圖1 浙江省淳安縣中囊病病毒全年檢出率調(diào)查Fig.1 Investigation of CSBV positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

2.2 浙江省淳安縣歐幼病病原全年流行規(guī)律

為調(diào)查浙江省淳安縣中蜂歐幼病病原流行規(guī)律，對(duì)該地區(qū)的5個(gè)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行了12個(gè)月的定點(diǎn)取樣。結(jié)果（圖2）顯示：隨著春繁開(kāi)始，蜂群內(nèi)蜂房球菌的感染率逐漸上升，直到7 月開(kāi)始下降；之后，隨著秋繁開(kāi)始，蜂房球菌的感染率再次上升，在10 月和11 月達(dá)到全年最高水平，為72%，而冬季蜂群內(nèi)蜂房球菌的感染率略有下降。

2.3 浙江省淳安縣中蜂的2 種病害混合感染變化規(guī)律

圖2 浙江省淳安縣歐幼病病原蜂房球菌全年檢出率調(diào)查Fig.2 Investigation of EFB positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析蜂群中囊病病毒和歐幼病病原全年檢出比例，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)：春季是中囊?。ú《静。┑母甙l(fā)季節(jié)，秋季是歐幼?。?xì)菌?。┑母甙l(fā)季節(jié)；中囊病和歐幼病共同發(fā)生的現(xiàn)象存在于全年的每個(gè)季節(jié)，其中在秋季病原混合感染比例最高，為17%；而健康蜂群比例較高的時(shí)期是夏季。

2.4 細(xì)菌病對(duì)蜂群中囊病病毒載量的影響

為了明確浙江省淳安縣蜂群CSBV載量變化情況，同時(shí)，了解蜂群內(nèi)的細(xì)菌病原是否影響病毒載量，本文采用絕對(duì)熒光定量的方法，對(duì)不同時(shí)期蜂群工蜂攜帶的CSBV 拷貝數(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)：在一年四季中，蜂群內(nèi)的CSBV載量均保持相對(duì)穩(wěn)定的水平；在秋季，中囊病和歐幼病共同存在的蜂群內(nèi)CSBV拷貝數(shù)顯著地高于單一檢出CSBV的蜂群，即歐幼病對(duì)CSBV載量影響顯著（P<0.05），而在其余季節(jié)歐幼病對(duì)CSBV載量的影響均不顯著。

3 討論

圖3 浙江省淳安縣中囊病病毒和歐幼病病原全年檢出率調(diào)查Fig.3 Investigation of CSBV and EFB positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

圖4 細(xì)菌病毒共感染蜂群與單一感染病毒蜂群CSBV拷貝數(shù)比較Fig.4 Comparison of CSBV copy number between cooccurrence of bacteria and virus and mono-occurrence of virus in honeybee colonies

本研究通過(guò)對(duì)浙江省淳安縣千島湖地區(qū)中蜂蜂群內(nèi)的工蜂進(jìn)行病原攜帶情況調(diào)查，獲得了中囊病和歐幼病這2種中蜂主要病害的病原全年流行規(guī)律，填補(bǔ)了董捷等[8]和郭蕊等[9]只開(kāi)展了冬季千島湖地區(qū)中蜂病害調(diào)查，而對(duì)該地區(qū)其他季節(jié)病害流行情況未知的空白，同時(shí)，為合理制定淳安縣中蜂病害全年防控措施提供了基礎(chǔ)資料和參考依據(jù)，也對(duì)當(dāng)?shù)刂蟹滟Y源保護(hù)具有重要的意義。

中囊病是危害中蜂最為嚴(yán)重的病毒病之一，該病害目前沒(méi)有特效的治療藥物，在生產(chǎn)中主要以預(yù)防為主[11]。因此，明確中囊病病原的全年流行規(guī)律，對(duì)于生產(chǎn)中指導(dǎo)蜜蜂飼養(yǎng)和預(yù)防病害發(fā)生至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在浙江省淳安縣千島湖地區(qū)一年四季中，中囊病病毒（CSBV）在工蜂中的攜帶率呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的規(guī)律，全年表現(xiàn)為由高到低隨后再升高的變化趨勢(shì)。該病毒病在春季感染率處于最高水平，這個(gè)趨勢(shì)與蜜蜂的春繁工作密切相關(guān)。春季氣溫處于不穩(wěn)定狀態(tài)，如果蜂群群勢(shì)調(diào)整不當(dāng)，往往會(huì)造成蜂群內(nèi)CSBV的擴(kuò)散，導(dǎo)致中囊病爆發(fā)，造成損失。到了炎熱夏季，病毒感染率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，夏末秋初，CSBV 又出現(xiàn)短時(shí)上漲，直到冬季該病毒感染率才有所下降。此次調(diào)查結(jié)果與中囊病的一般發(fā)病時(shí)期基本一致，即氣候變化大，溫濕度不穩(wěn)定時(shí)，處于繁殖期的蜂群容易發(fā)病。這與吳政報(bào)道的其他地區(qū)中蜂病害流行調(diào)查結(jié)果[12]一致。綜合中囊病發(fā)病規(guī)律，在早春和越冬期做好中蜂保溫工作，發(fā)病前完成換王，是中囊病防治工作的關(guān)鍵。

歐幼病是由意大利蜜蜂傳入中蜂蜂群的一種細(xì)菌病。據(jù)報(bào)道，該病害一般在春末夏初和夏末秋初感染率處于較高水平，基本與蜂群繁殖高峰期相重疊，即與春繁、秋繁相重疊；大流蜜期到來(lái)的時(shí)候，該病害常?！白杂保湓蚺c群內(nèi)待哺幼蟲(chóng)數(shù)量減少有關(guān)[13]。本研究開(kāi)展中蜂病害調(diào)查的地點(diǎn)是浙江省淳安縣千島湖地區(qū)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)蜂群歐幼病在春季的感染率較低，與該病害的一般發(fā)病規(guī)律不同。這可能與當(dāng)?shù)胤淙猴曫B(yǎng)方式有關(guān)，因?yàn)榉浞壳蚓膫鞑ブ饕怯擅鄯涞牟杉顒?dòng)和養(yǎng)蜂者不合理的操作引起的，而該地區(qū)的中蜂飼養(yǎng)與意大利蜜蜂的大規(guī)模飼養(yǎng)不同，該地中蜂蜂群往往都是采取傳統(tǒng)的定地放養(yǎng)模式，一般一年取蜜1～2 次，蜂群受人為干擾因素相對(duì)較少。

大多數(shù)蜜蜂研究者一致認(rèn)為，蜂群損失不能歸因于單一的因素，而是不同生物及非生物壓力源相互作用的結(jié)果[14]。病毒與細(xì)菌等病原的混合感染，往往是人類或家畜疾病防控難的主要因素，在蜜蜂中也不例外。本研究發(fā)現(xiàn)，中囊病（病毒?。┖蜌W幼病（細(xì)菌?。┻@2種病害的病原在中蜂蜂群內(nèi)表現(xiàn)出共同存在的現(xiàn)象。這2 種病害均是從感染1—2 日齡小幼蟲(chóng)開(kāi)始，雖然致病機(jī)制不同，但是本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：秋季蜂群內(nèi)2種病害共同存在情況的出現(xiàn)，會(huì)引起蜂群內(nèi)CSBV 載量顯著升高的現(xiàn)象，表明在細(xì)菌和病毒這2 種同為蜜蜂幼蟲(chóng)致病的病原之間，在特定條件下可能存在相互促進(jìn)的現(xiàn)象。因此，二者之間是否存在相互促進(jìn)致病的關(guān)系及其作用機(jī)制仍有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)中蜂中囊病和歐幼病這2種幼蟲(chóng)病在蜂群內(nèi)的病原重要傳播者——工蜂進(jìn)行了病原調(diào)查與檢測(cè)，明確了在浙江省淳安縣千島湖地區(qū)的中蜂中這2 種主要病原在蜂群內(nèi)的全年流行情況。研究發(fā)現(xiàn)：該地區(qū)中囊病和歐幼病的病原在工蜂中的攜帶情況具有明顯的季節(jié)性，春季中囊病病原CSBV 檢出率最高，秋季歐幼病病原蜂房球菌檢出率最高；同時(shí)，這2種病原在蜂群中均存在混合感染的情況，且2 種病原共同存在會(huì)引起秋季蜂群內(nèi)CSBV載量顯著升高。這些結(jié)果可為合理制定淳安縣中蜂病害的全年防治措施提供科學(xué)依據(jù)。