2種內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻的胞外分泌物研究

鄧茹茹，馬帥，譚德冠，付莉莉，張家明，孫雪飄，劉平懷

（1.海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院/海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

微藻是一類(lèi)古老的低等植物，其光合利用程度高，生長(zhǎng)速度快，生物量大，且富含多種營(yíng)養(yǎng)元素和活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域。微藻在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)不斷地向周?chē)h(huán)境釋放多種類(lèi)型的代謝產(chǎn)物，如碳水化合物、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、脂類(lèi)、維生素、毒素等，這些產(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為胞外分泌物[1]。微藻胞外分泌物不僅對(duì)微藻本身的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、光合作用以及生態(tài)環(huán)境調(diào)節(jié)起重要作用[2-4]，有的還具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、凈化水質(zhì)等多種生物學(xué)功能[5-7]。例如：柵藻（Scenedesmussp.）的胞外分泌物對(duì)其自身的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程都有明顯抑制，雨生紅球藻（Haematococcus pluvislis）的胞外分泌物對(duì)其自身在穩(wěn)定期后期有明顯抑制[8]；銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的胞外酸性多糖具有抗腫瘤作用[9]，球等鞭金藻（Isochrysis galbana）的胞外多糖具有抗氧化活性[10]。因此，對(duì)微藻胞外分泌物的深入研究對(duì)微藻的高效培養(yǎng)、養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控以及其在醫(yī)藥保健、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

微藻種類(lèi)繁多，分布廣泛，在海洋、湖泊、陸地等各類(lèi)環(huán)境中均有分布，其中以附生于植物樹(shù)干表皮較為常見(jiàn)。而內(nèi)生于高等植物細(xì)胞內(nèi)部的微藻極為罕見(jiàn)，目前報(bào)道的僅有2 例，分別是TRéMOUILLAUX-GUILLER 等在銀杏細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的一種膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea）[11]和筆者所在的實(shí)驗(yàn)室人員從橡膠樹(shù)細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的海南橡藻（Heveochlorella hainanensis）[12]。本實(shí)驗(yàn)選取橡藻屬2種綠藻，一種為內(nèi)生的海南橡藻，另一種為附生于王棕樹(shù)干表皮的王棕橡藻（Heveochlorella roystonensis）[13]，研究這2 種內(nèi)生和附生的近源綠藻資源的代謝差異，對(duì)探究藻類(lèi)進(jìn)化規(guī)律具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，海南橡藻和王棕橡藻雖然是同屬的2個(gè)近源種，但生活方式差異明顯。王棕橡藻可通過(guò)自養(yǎng)生長(zhǎng)，但海南橡藻在缺乏外源有機(jī)碳源的條件下生長(zhǎng)極為緩慢，雖然補(bǔ)充有機(jī)碳源能使海南橡藻快速生長(zhǎng)發(fā)育，但培養(yǎng)后期培養(yǎng)液pH明顯下降，藻細(xì)胞從逐漸凋亡至全部死亡。培養(yǎng)液成分的變化與微藻胞外分泌物密切相關(guān)。為深入探討這2種不同生活方式的內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻的胞外分泌物之間的差異，本研究通過(guò)測(cè)定這2種藻的生物量和培養(yǎng)液pH，并采用非靶向代謝物組學(xué)分析的方法對(duì)其胞外分泌物進(jìn)行測(cè)定，以期從代謝物的角度分析不同生活方式的橡藻屬藻種間的代謝差異，以及添加有機(jī)碳源對(duì)兩者差異性的影響，旨在為海南橡藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化、其在適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中的變化特征揭示和微藻胞外分泌物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試藻株

實(shí)驗(yàn)所用藻株為本實(shí)驗(yàn)室從橡膠樹(shù)細(xì)胞內(nèi)部和王棕樹(shù)干表皮分離獲得，分別為海南橡藻（XJ）和王棕橡藻（A3-8），保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)條件

將2 種供試藻接種至Tris-乙酸鹽-磷酸鹽（Tris-acetate-phosphate,TAP）培養(yǎng)基和TAP＋0.5%蔗糖培養(yǎng)基（通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)量分?jǐn)?shù)最有利于海南橡藻的快速生長(zhǎng)發(fā)育）中，并在24 ℃、光照條件下以150 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高壓液相色譜儀和Agilent 6545 QTOF 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 科技公司）、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.8 μm，美國(guó)Waters 公司）、HVE-50 高溫高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）、2-16K 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）、ATL-032LR 恒溫培養(yǎng)箱（上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胞外分泌代謝物的制備

分別配置細(xì)胞數(shù)量為1×106mL－1的海南橡藻、王棕橡藻懸液。將2種藻的懸液按10%的接種量分別接種于含0.5%蔗糖和無(wú)蔗糖的TAP 液體培養(yǎng)液中，在24 ℃、光照培養(yǎng)條件下以150 r/min振蕩培養(yǎng)15 d（此時(shí)2種藻的生長(zhǎng)到達(dá)平臺(tái)期，海南橡藻開(kāi)始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象）。培養(yǎng)液于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，測(cè)量pH；并立即將上清液保存于－80 ℃超低溫冰箱中。

1.3.2 待測(cè)樣品的預(yù)處理

將待測(cè)樣品于4 ℃條件下解凍后，取1 000 μL樣品，加入4 000 μL體積比為1∶1的甲醇-乙腈溶液，渦旋60 s；于－20 ℃條件下沉淀60 min，4 ℃、1.7×104g離心15 min；取上清液，于35 ℃條件下真空抽干后，用200 μL體積比為1∶1的乙腈-水重新溶解，用0.22 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜過(guò)濾；取濾液100 μL，待上機(jī)，另取5 μL進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)。

1.3.3 代謝物組學(xué)分析

將制備好的待測(cè)樣品進(jìn)行非靶向代謝物分析，測(cè)試條件如下：Agilent 6545A QTOF 高分辨質(zhì)譜儀在控制軟件下基于自動(dòng)串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrum,MS/MS）模式，進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，質(zhì)量掃描范圍（m/z）為50～1 100。分別采用正、負(fù)離子模式采集；柱溫40 ℃，上樣量1 μL。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，并使用新復(fù)極差法（鄧肯法）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。其中，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)碳源對(duì)海南橡藻與王棕橡藻生物量和培養(yǎng)液pH 的影響

由表1可見(jiàn)：采用TAP培養(yǎng)液培養(yǎng)15 d后，海南橡藻的生物量（按干質(zhì)量計(jì)）僅為0.09 g/L，培養(yǎng)液pH由最初的6.93下降至6.63；王棕橡藻的生物量為3.20 g/L，培養(yǎng)液pH上升至7.43。添加0.5%蔗糖作為有機(jī)碳源時(shí)，王棕橡藻生物量增長(zhǎng)了63.75%，達(dá)5.24 g/L，培養(yǎng)液pH 上升明顯，達(dá)8.32；海南橡藻生物量顯著增加，達(dá)3.87 g/L，培養(yǎng)液pH明顯下降，為4.70。上述結(jié)果表明：不加有機(jī)碳源時(shí)，內(nèi)生的海南橡藻生長(zhǎng)極緩慢，而附生的王棕橡藻生長(zhǎng)迅速；在生長(zhǎng)過(guò)程中，海南橡藻產(chǎn)生的酸性胞外分泌物偏多，使培養(yǎng)液酸化，而王棕橡藻分泌的堿性代謝物偏多，使培養(yǎng)液堿化，即2 種藻培養(yǎng)液的pH 變化趨勢(shì)相反。添加有機(jī)碳源時(shí)，2 種藻的生長(zhǎng)速率均有顯著提升，其中對(duì)海南橡藻生長(zhǎng)繁殖的促進(jìn)作用更好；同時(shí)，隨著2種藻生物量的增加，培養(yǎng)液pH變化更為明顯，王棕橡藻的培養(yǎng)液達(dá)弱堿性，海南橡藻的培養(yǎng)液達(dá)強(qiáng)酸性，藻細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。

2.2 海南橡藻與王棕橡藻的胞外分泌物種類(lèi)分析

對(duì)2種藻的胞外分泌物進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)到141種分泌物（表2），主要包括有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸及其衍生物、糖類(lèi)、酯類(lèi)、胺類(lèi)及生物堿、酮醇類(lèi)等。其中：氨基酸及其衍生物的種類(lèi)最多，共有35種，占總數(shù)的25%；胺類(lèi)及生物堿次之，共有22種，占總數(shù)的17%；糖類(lèi)最少，僅2種，占總數(shù)的1.42%。在2種藻的胞外分泌物中，海南橡藻擁有8 種特有的胞外分泌物，分別為羧酸、泛酸、5′-脫氧腺苷、N-乙酰-dl-蛋氨酸、脫氧核糖、氯苯吡胺、F-脒、L-硫代瓜氨酸二鹽酸；王棕橡藻擁有6種特有的胞外分泌物，分別為香豆苷、苯丙氨酸、纈氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-丙氨酸、組氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺、內(nèi)酯二醇、右旋異黃烷。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在海南橡藻特有的胞外分泌物中酸性物質(zhì)的種類(lèi)較多。

表1 培養(yǎng)15 d后海南橡藻與王棕橡藻生物量和培養(yǎng)液pH的比較Table 1 Comparison of biomass and pH of culture media between H.hainangensis and H.roystonensis after 15 d

1）生物量按干質(zhì)量計(jì)。同行數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1) Biomass is calculated by dry mass. The values within the same row followed by different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

表2 海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物種類(lèi)Table 2 Extracellular metabolite species of H.hainangensis and H.roystonensis

2.3 海南橡藻與王棕橡藻的胞外分泌物相對(duì)含量分析

從整體上看，海南橡藻與王棕橡藻的胞外分泌物中不同類(lèi)型代謝物的相對(duì)含量占比較為相似。在不加有機(jī)碳源和添加0.5%蔗糖作為有機(jī)碳源的培養(yǎng)條件下，2 種藻的胞外分泌物中氨基酸及其衍生物的相對(duì)含量均為最高，胺類(lèi)及生物堿次之，糖類(lèi)最低（表3）。通過(guò)比較可以看出：不加有機(jī)碳源時(shí)，海南橡藻的有機(jī)酸相對(duì)含量占比是王棕橡藻的1.61 倍，胺類(lèi)及生物堿相對(duì)含量占比是王棕橡藻的1.22 倍，而王棕橡藻的核苷酸相對(duì)含量占比明顯高于海南橡藻，為其2.30 倍。添加有機(jī)碳源后，海南橡藻糖類(lèi)、酯類(lèi)占比顯著上升，分別增加了73.33%、71.58%，而王棕橡藻糖類(lèi)占比無(wú)變化，脂類(lèi)占比僅上升15.78%；王棕橡藻和海南橡藻酮醇類(lèi)占比均有所下降，分別降低了26.91%和32.37%；王棕橡藻胞外分泌物中核苷酸相對(duì)含量占比幾乎沒(méi)有變化，而海南橡藻胞外分泌物中核苷酸相對(duì)含量占比增長(zhǎng)得最多，增加了175.86%，增加后占比反而高于王棕橡藻；王棕橡藻胞外分泌物中有機(jī)酸相對(duì)含量占比有所下降，降低了44.61%，而海南橡藻有機(jī)酸相對(duì)含量占比反而明顯上升，增加了41.46%，增加后海南橡藻有機(jī)酸相對(duì)含量是王棕橡藻的4.11倍；王棕橡藻胺類(lèi)及生物堿相對(duì)含量占比略微上升，而海南橡藻的反而略微下降。

表3 海南橡藻與王棕橡藻胞外分泌物各種類(lèi)占比Table 3 Proportion of extracellular metabolite types isolated from the culture media of H.hainangensis and H.roystonensis %

2.4 海南橡藻與王棕橡藻胞外分泌物中有機(jī)酸組成分析

如表4所示，在2種培養(yǎng)條件下，從海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中共檢測(cè)到12 種有機(jī)酸。其中：不加有機(jī)碳源時(shí)，王棕橡藻被檢測(cè)到8 種有機(jī)酸；添加有機(jī)碳源后，增加了乙酰乙酸和甲基乙烯酸。不加有機(jī)碳源時(shí)，海南橡藻被檢測(cè)到10種有機(jī)酸；添加有機(jī)碳源后，增加了泛酸和甲基乙烯酸。整體上看，海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中有機(jī)酸組成有一定的相似性，兩者擁有10 種共有成分，但各種有機(jī)酸相對(duì)含量在總有機(jī)酸中的占比差異較大；同時(shí)，有機(jī)碳源的添加對(duì)兩者有機(jī)酸成分的組成和相對(duì)占比均有較大影響。

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)：海南橡藻中維生素A 酸相對(duì)含量在總有機(jī)酸中的占比最高，不加有機(jī)碳源時(shí)占比為31.64%，添加有機(jī)碳源后高達(dá)61.73%。王棕橡藻在不加有機(jī)碳源時(shí)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸相對(duì)含量在總有機(jī)酸中的占比最高，達(dá)46.42%；添加有機(jī)碳源后維生素A 酸占比最高，為23.59%。添加有機(jī)碳源后，2 種藻胞外分泌的有機(jī)酸中硅酸、維生素A 酸以及甲基乙烯酸3 種酸性物質(zhì)占比均有所提升，其中甲基乙烯酸均為從無(wú)到有；兩者維生素A 酸的增幅均為最大，海南橡藻由31.64%增至61.73%，王棕橡藻由5.41%增至23.59%。添加有機(jī)碳源后，2 種藻胞外分泌的有機(jī)酸中有3 種占比均下降，分別為N-羧乙基-γ-氨基丁酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、11，14-反式二十碳二烯酸。此外，添加有機(jī)碳源后，海南橡藻胞外分泌的有機(jī)酸中乙酰乙酸、5-氨基乙酰丙酸、2-氨基十六酸、甲基戊酸等4 種有機(jī)酸占比下降，而王棕橡藻反而上升。

表4 海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中有機(jī)酸組分占總有機(jī)酸的比例Table 4 Proportion of organic acids to total organic acids of extracellular metabolites isolated from the culture media of H.hainangensis and H.roystonensis%

3 討論

在2 種內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻中，附生的王棕橡藻在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液pH 升高，與大多數(shù)自養(yǎng)型微藻培養(yǎng)液pH 變化一致。例如，赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）、塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense） 和 中 肋 骨 條 藻（Skeletonema costatum）在生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液pH 均呈現(xiàn)上升的現(xiàn)象[14-15]；藍(lán)藻（Cyanobacteria）水華會(huì)導(dǎo)致水體pH上升[16]；小球藻（Chlorella vulgaris）、銅綠微囊藻、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）在生長(zhǎng)過(guò)程中均能使水環(huán)境pH上升[17-18]。前人研究表明，自養(yǎng)型微藻在光合作用過(guò)程中，可通過(guò)碳酸酐酶產(chǎn)生OH－，并分泌到細(xì)胞外，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液的pH[19]，使之更適宜于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。而內(nèi)生的海南橡藻在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液逐漸酸化，在增加有機(jī)碳源后，酸化程度增強(qiáng)，導(dǎo)致藻細(xì)胞凋亡。這種培養(yǎng)液酸化的現(xiàn)象與大多數(shù)自養(yǎng)型微藻相反，該差異可能與海南橡藻在進(jìn)化過(guò)程中，長(zhǎng)期的內(nèi)生環(huán)境導(dǎo)致與光合作用相關(guān)的基因丟失、不表達(dá)或者是產(chǎn)酸的相關(guān)代謝通路發(fā)生改變有一定關(guān)系。

2種內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻的胞外分泌物種類(lèi)繁多，其中，氨基酸及其衍生物種類(lèi)最多，其次是胺類(lèi)和生物堿。氨基酸及其衍生物在生命體的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，還可作為飼料和食品添加劑，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。2 種藻胞外能分泌大量氨基酸及其衍生物，表明其有可能作為細(xì)胞工廠來(lái)實(shí)現(xiàn)多種氨基酸及其衍生物的生物合成[20]。胺類(lèi)及生物堿也是生物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，具有抗病、抗逆等作用。2種橡藻屬綠藻胞外分泌了22種胺類(lèi)及生物堿，其中一些具有良好的應(yīng)用價(jià)值，例如，1-脫氧野尻霉素具有降糖、抗病毒和抗腫瘤等功效[21]。同時(shí)，從2 種綠藻中檢測(cè)出的12種有機(jī)酸具有廣泛的生物學(xué)活性[22]，其中，維生素A酸是維生素A的中間代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)發(fā)育等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用；而5-氨基乙酰丙酸則是生物體內(nèi)吡咯生物合成途徑的關(guān)鍵中間產(chǎn)物[23]，也是諸如葉綠素、血紅素、維生素B12等四吡咯的前體，可作為能降解的殺蟲(chóng)劑，也可被用作植物生長(zhǎng)促進(jìn)因子[24]?？傊瑢?duì)2 種內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻胞外分泌物的鑒定，發(fā)現(xiàn)了一批具有潛在開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的分泌物，這為2 種藻的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

比較2種藻胞外分泌物中各類(lèi)型代謝物相對(duì)含量占比發(fā)現(xiàn)，差異較為明顯的主要是核苷酸和有機(jī)酸。在核苷酸方面，不加有機(jī)碳源時(shí)，海南橡藻胞外分泌物中核苷酸相對(duì)含量占比低于王棕橡藻，這與自養(yǎng)條件下海南橡藻生長(zhǎng)緩慢、生物量極少有關(guān)；而添加有機(jī)碳源后，海南橡藻核苷酸占比大幅增加，增加后反而高于王棕橡藻，這可能與補(bǔ)充有機(jī)碳源后，海南橡藻快速生長(zhǎng)并在后期因培養(yǎng)液酸化大量凋亡解體有一定關(guān)系。在有機(jī)酸方面，不加有機(jī)碳源時(shí)，2 種藻的有機(jī)酸相對(duì)含量占比相差僅0.61 倍。添加有機(jī)碳源后，海南橡藻有機(jī)酸占比增加，王棕橡藻反而降低，兩者相差達(dá)3.11倍，該變化差異與2種藻培養(yǎng)液酸堿變化的差異一致。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，海南橡藻擁有羧酸和泛酸2 種特有的有機(jī)酸。其中：羧酸是三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物，對(duì)藻在一定程度上有殺滅和抑制作用[25]，海南橡藻生長(zhǎng)緩慢可能與其分泌的羧酸對(duì)自身細(xì)胞的抑制作用存在一定的關(guān)系。泛酸是輔酶A 和酰基載體蛋白生物合成的重要前體物質(zhì)，參與生物體內(nèi)碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)和能量代謝[26-27]；泛酸在脂肪酸代謝中有重要作用，對(duì)脂肪酸的合成具有促進(jìn)效果[28]。前期研究發(fā)現(xiàn)，添加有機(jī)碳源后，海南橡藻油脂含量明顯升高，這可能與其在有機(jī)碳源的促進(jìn)下，產(chǎn)生大量泛酸有一定的關(guān)系。此外，不同于自養(yǎng)型綠藻，海南橡藻在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)培養(yǎng)液酸化的現(xiàn)象，可能是其適應(yīng)內(nèi)生環(huán)境過(guò)程中的一種自我抑制現(xiàn)象。海南橡藻可能通過(guò)分泌羧酸等酸性物質(zhì)，調(diào)控外界環(huán)境和自身生長(zhǎng)繁殖，以控制其內(nèi)生于宿主中的數(shù)量。該特異現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與海南橡藻在長(zhǎng)期內(nèi)生過(guò)程中相關(guān)代謝途徑發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化有一定的關(guān)系。

4 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)2種內(nèi)生和附生橡藻屬綠藻在培養(yǎng)過(guò)程中生物量、培養(yǎng)液pH 以及胞外分泌物進(jìn)行研究表明：在培養(yǎng)過(guò)程中海南橡藻培養(yǎng)液呈酸性變化，王棕橡藻的呈堿性變化；不加有機(jī)碳源時(shí)，海南橡藻生長(zhǎng)極為緩慢，王棕橡藻可以正常生長(zhǎng)；添加有機(jī)碳源能明顯促進(jìn)2 種藻的生長(zhǎng)繁殖，其中對(duì)海南橡藻的促進(jìn)作用尤為明顯。同時(shí)，添加有機(jī)碳源會(huì)加劇2種藻培養(yǎng)液酸堿化的變化程度，其中，海南橡藻培養(yǎng)液達(dá)強(qiáng)酸性，使其自身逐漸凋亡。2 種藻的胞外分泌物共有141種，種類(lèi)豐富多樣，兩者共有的種類(lèi)有127 種；在特有種類(lèi)中，海南橡藻有8 種，王棕橡藻有6種，其中，海南橡藻有羧酸和泛酸2種特有的有機(jī)酸。2 種藻胞外分泌物中有機(jī)酸、核苷酸的相對(duì)含量占比差異較為明顯。添加有機(jī)碳源能明顯促進(jìn)海南橡藻有機(jī)酸的分泌，抑制王棕橡藻有機(jī)酸的分泌，使得兩者培養(yǎng)液酸堿性變化的差異性更為顯著。

微藻胞外分泌物復(fù)雜多樣，但相關(guān)研究相對(duì)較少，而非靶向代謝組學(xué)的分析運(yùn)用，可增加微藻胞外分泌物的覆蓋范圍，為研究藻類(lèi)對(duì)外界的響應(yīng)提供了廣闊前景。本文從培養(yǎng)液酸堿性變化及藻胞外分泌物組分分析的角度開(kāi)展研究，為進(jìn)一步研究橡藻屬附生/內(nèi)生藻種適應(yīng)性進(jìn)化，發(fā)掘具有特殊活性、高開(kāi)發(fā)價(jià)值的微藻胞外分泌物提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。