昆蟲N6-甲基腺嘌呤的研究進(jìn)展

趙書荻，吳小鋒,2*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶蜂研究所，杭州 310058；2.浙江省蠶蜂資源利用與創(chuàng)新研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

RNA修飾是真核生物中典型的表觀修飾方式，通過行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能來響應(yīng)環(huán)境的改變。目前，已有150 余種RNA 修飾被發(fā)現(xiàn)于不同類型的RNA 中[1]，其中N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是最常見的一種RNA修飾[2]，它廣泛存在于低等到高等的各種真核生物中，包括真菌（酵母）[3]、植物[4]、昆蟲[5]和哺乳動(dòng)物[6]。m6A 能夠影響RNA 加工和代謝中的可變剪接[7]、出核轉(zhuǎn)運(yùn)[8]、翻譯[9]和穩(wěn)定性[10]，從而在生物發(fā)育、疾病、干細(xì)胞分化、免疫和行為控制等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[11]。

早在20 世紀(jì)70 年代，m6A 就已被發(fā)現(xiàn)[12]，但有關(guān)其機(jī)制和功能的深入研究直到2010 年左右才逐漸開始[3]。此后，隨著RNA 甲基化研究技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是甲基化RNA 免疫共沉淀測序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)[13-14]技術(shù)的應(yīng)用與改進(jìn)[15]，對(duì)m6A 研究的進(jìn)展并助推其逐漸成為表觀遺傳學(xué)前沿的研究熱點(diǎn)作出了突出貢獻(xiàn)。在昆蟲領(lǐng)域以果蠅為主要模式生物的相關(guān)研究也取得了很大突破。本文主要介紹和總結(jié)近年來在昆蟲方面m6A的研究進(jìn)展，闡述其在昆蟲中的動(dòng)態(tài)調(diào)控和生物學(xué)功能。

1 m6A 的動(dòng)態(tài)調(diào)控

在昆蟲體內(nèi)，m6A修飾是一個(gè)可逆的過程，其豐度可根據(jù)生理需求或環(huán)境變化而發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，從而調(diào)控自身的生理狀態(tài)[16]。

1.1 m6A 的調(diào)控酶與識(shí)別蛋白

m6A 的動(dòng)態(tài)調(diào)控是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（methyltransferase complex, MTC）和去甲基化酶的雙向調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，m6A修飾能夠被帶有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白識(shí)別從而調(diào)控下游通路（圖1）。m6A的調(diào)控酶和識(shí)別蛋白最早是從人類細(xì)胞中被分離并命名的[17]，其同源物廣泛存在于包括果蠅和家蠶在內(nèi)的多種模式生物中[18-19]（圖2）。

1.1.1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體

m6A 的甲基轉(zhuǎn)移酶主要由METTL3、METTL14[20]、WTAP[21]、KIAA1429 和 RBM15/RBM15B[22]構(gòu)成，在果蠅中，它們的同源物分別為Ime4、KAR4、Fl(2)d、Vir和Nito[18]。

METTL3是MTC上一個(gè)保守的亞基，具有將甲基從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine,SAM）轉(zhuǎn)移到m6A 位點(diǎn)的催化活性[23]，在甲基化過程中起核心作用。METTL14 能夠穩(wěn)定Ime4 與RNA 的結(jié)合，它同樣具有催化甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域，但由于相鄰基團(tuán)的空間約束使其無法與SAM 結(jié)合[24]。WTAP也是在MTC中起輔助作用的酶，它本身不能介導(dǎo)甲基轉(zhuǎn)移，也無法影響METTL3-14 復(fù)合體的催化活性，但它可以使MTC 定位在mRNA 前體（pre-mRNA）修飾因子富集的核散斑體（nuclear speckles）上，這些因子可以提高M(jìn)TC 的催化活性[25]。METTL3、METTL14 和WTAP 構(gòu)成MTC 的核心，其他2 個(gè)成分KIAA1429 和RBM15 則與引導(dǎo)MTC識(shí)別并結(jié)合特定的mRNA有關(guān)[22,26]。

1.1.2 去甲基化酶

目前已發(fā)現(xiàn)的m6A 去甲基化酶有2 種，分別是FTO[27]和ALKBH5[28]。FTO 最初被發(fā)現(xiàn)是由于它能夠催化單鏈DNA 的去甲基化反應(yīng)[29]，在這個(gè)基礎(chǔ)上，JIA 等[27]發(fā)現(xiàn)FTO 在體外能夠消除RNA 的m6A修飾，干擾FTO 的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞m6A 的積累，而其過表達(dá)則會(huì)使m6A修飾水平降低。

圖1 m6A的動(dòng)態(tài)調(diào)控與識(shí)別蛋白Fig.1 Dynamic regulation and reader proteins of m6A

ALKBH5 同樣能催化m6A 去甲基化反應(yīng)，但其序列特異性較強(qiáng)，無法識(shí)別單鏈RNA上其他類型的甲基化修飾；ALKBH5 定位在細(xì)胞核內(nèi)，其缺失會(huì)導(dǎo)致新合成的mRNA無法形成多聚A（polyA）尾[27]。這說明ALKBH5 在mRNA 出核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中具有重要意義，同時(shí)也暗示了m6A修飾在mRNA成熟過程中的重要作用。

1.1.3 m6A 識(shí)別蛋白

m6A的修飾作用需要識(shí)別蛋白的選擇性結(jié)合才能發(fā)揮，m6A 的功能性結(jié)合蛋白主要有YTHDC 家族的YTHDC1、YTHDC2 和YTHDF 家族的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3。

YTHDC1 是定位在細(xì)胞核內(nèi)的m6A 識(shí)別蛋白[30]，能夠識(shí)別外顯子上的m6A修飾來調(diào)控RNA剪接[31]，還能通過與RNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)因子互作來促進(jìn)成熟RNA 的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。YTHDC2 和YTHDF 家族成員都是定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的m6A 識(shí)別蛋白，其中：YTHDF1 參與mRNA 翻譯的起始并能夠增強(qiáng)其翻譯效率，YTHDF2 則能夠加快帶有m6A 修飾的mRNA 的降解[32]，而YTHDF3 和YTHDC2 能夠同時(shí)影響mRNA的翻譯與降解[33-34]。

1.2 m6A 的分布

m6A的修飾位點(diǎn)具有一定的規(guī)律性。對(duì)果蠅和家蠶進(jìn)行MeRIP-seq 分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)m6A 修飾位點(diǎn)出現(xiàn)在RRACH 序列[35-36]（其中R 指嘌呤，H 指非G堿基）上，說明m6A修飾具有序列特異性，但相鄰堿基在m6A修飾中的功能尚不明確。

圖2 不同物種m6A相關(guān)蛋白同源物系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of homologous proteins related to m6A of various species

在果蠅和家蠶中，m6A 主要分布于成熟mRNA的非翻譯區(qū)（untranslated region, UTR）和外顯子上[35-36]（圖3A～B），并在起始和終止密碼子附近集中分布[15]，這暗示了m6A 在調(diào)控RNA 的出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和穩(wěn)定性中的重要作用。當(dāng)細(xì)胞處于不同的環(huán)境狀態(tài)時(shí)，其m6A的分布會(huì)有很大的差異。在體外培養(yǎng)的家蠶細(xì)胞中，其內(nèi)含子中m6A修飾水平顯著高于體內(nèi)細(xì)胞的內(nèi)含子中m6A修飾水平[37]（圖3B～C），這可能與m6A對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞mRNA剪接的調(diào)控增強(qiáng)有關(guān)。雖然目前并沒有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但可以確定的是，體內(nèi)細(xì)胞受到內(nèi)環(huán)境中各種因子的作用，m6A 分布的差異必然與這些因子的調(diào)控作用有關(guān)。當(dāng)被家蠶核型多角體病毒（BnPNV）感染后，家蠶中腸mRNA的m6A分布也會(huì)發(fā)生改變，3′UTR的m6A 水平升高，而外顯子的m6A 水平顯著下降[37]（圖3B 和D），這可能與病毒感染細(xì)胞后降低宿主mRNA的穩(wěn)定性和抑制其出細(xì)胞核翻譯有關(guān)。

2 m6A 的生物學(xué)功能

m6A 修飾能夠影響mRNA 的代謝，從而調(diào)控個(gè)體的生命活動(dòng)。這一過程主要通過相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)特定組織或特定RNA中的m6A水平來實(shí)現(xiàn)。目前，在昆蟲中已知的m6A 參與調(diào)控的生命活動(dòng)主要有性別分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞分裂；除此之外，m6A調(diào)控酶和結(jié)合蛋白還具有其他一系列生物學(xué)功能（表1），但這些功能是否都與m6A 有關(guān)并未得到完全驗(yàn)證。

2.1 m6A 控制果蠅的性別分化

果蠅的性染色體為X 和Y，X 染色體的數(shù)目決定果蠅的性別，在這一過程中起關(guān)鍵作用的是Sxl基因。在XX 型果蠅中，Sxl正常表達(dá)，其下游有2條通路：一方面，Sxl激活下游tra的表達(dá)，TRA 能夠與雌雄個(gè)體中均存在的TRA2 一起調(diào)控DSX 的剪接，這樣產(chǎn)生的DSXF能夠使雄性發(fā)育所需的基因無法表達(dá)；另一方面，Sxl抑制msl-2的表達(dá)，使其介導(dǎo)的劑量補(bǔ)償效應(yīng)無法產(chǎn)生，從而使個(gè)體發(fā)育為雌性（圖4A）。而在XY 個(gè)體中，Sxl不能正常表達(dá)，DSX 被以另一種方式剪接，這樣產(chǎn)生的DSXM會(huì)抑制雌性發(fā)育所需基因的表達(dá)，同時(shí)，msl-2的表達(dá)被激活，產(chǎn)生劑量補(bǔ)償效應(yīng)，使個(gè)體正常發(fā)育為雄性（圖4B）[45]。

圖3 m6A修飾在mRNA中的位置分布Fig.3 Location of m6A modification in mRNA

表1 m6A相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能Table 1 Biological functions of m6A related proteins

m6A 修飾能夠通過影響Sxl的可變剪接來影響其表達(dá)，從而控制果蠅的性別分化。Sxl在雌雄個(gè)體中有2種不同的剪接形式（圖5）。在雌性個(gè)體中，包含終止密碼子的外顯子3 被剪切，SXL 編碼蛋白可以正常合成[38]。缺失Ime4基因的雌性果蠅存活率明顯降低，這一現(xiàn)象可通過補(bǔ)回Ime4或移除msl-2以抑制劑量補(bǔ)償效應(yīng)來拯救，但部分存活的雌性果蠅會(huì)產(chǎn)生雄性特有的性狀[18]。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，缺失Ime4導(dǎo)致m6A 水平下降和Sxl的正常剪接減少[40]，同時(shí)會(huì)抑制Sxl在生殖細(xì)胞和胚胎中的表達(dá)[39]，說明m6A能夠通過影響Sxl的可變剪接來調(diào)控其下游通路，從而介導(dǎo)果蠅的性別分化。

2.2 m6A 調(diào)節(jié)果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的功能

在果蠅的生命周期中，m6A 修飾水平會(huì)隨發(fā)育階段的不同而發(fā)生變化，m6A 的水平直接影響果蠅的發(fā)育，尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的完善具有至關(guān)重要的作用。

果蠅胚胎的RNA原位雜交結(jié)果顯示，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和識(shí)別蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富集表達(dá)。當(dāng)果蠅的Ime4基因被敲除后，果蠅壽命縮短且出現(xiàn)明顯的行為缺陷，包括喪失飛行和運(yùn)動(dòng)能力、翅膀伸出等。在全身或神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)Ime4 可以拯救這些行為缺陷，而在中胚層中表達(dá)則沒有效果。觀察發(fā)現(xiàn)，缺失Ime4基因的果蠅的神經(jīng)肌肉接頭生長旺盛，突觸增多且出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象。取腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，存在差異表達(dá)或剪接的基因多與運(yùn)動(dòng)有關(guān)；將這些基因與細(xì)胞m6A 測序結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其中存在大量m6A 修飾位點(diǎn)[40]。這些結(jié)果說明，果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能依賴大量m6A修飾的調(diào)控，當(dāng)m6A 修飾被干擾后，就會(huì)影響下游相關(guān)基因的表達(dá)和剪接，從而使個(gè)體的發(fā)育和行為產(chǎn)生缺陷。

圖4 Sxl介導(dǎo)性別分化的下游通路Fig.4 Downstream pathways of sexual differentiation mediated by Sxl

圖5 Sxl mRNA的可變剪接Fig.5 Alternative splicing of Sxl mRNA

2.3 m6A 影響細(xì)胞周期

對(duì)脊椎動(dòng)物的研究表明，m6A 能夠控制干細(xì)胞的分化和凋亡，而在昆蟲中，m6A對(duì)細(xì)胞分裂具有重要的調(diào)控作用[46]。敲除果蠅的Ime4基因會(huì)導(dǎo)致果蠅卵巢出現(xiàn)缺陷：卵泡與多余的滋養(yǎng)細(xì)胞混合，其中的卵細(xì)胞無法定位在卵泡上，也無法完成后續(xù)的有絲分裂，并在卵黃形成前被降解。這直接導(dǎo)致果蠅無法正常產(chǎn)生卵細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，缺失Ime4基因的果蠅中Notch通路的激活被下調(diào)。在這些果蠅的卵巢中過表達(dá)活化的Notch 蛋白后，則不再出現(xiàn)卵巢缺陷[5]。這些結(jié)果說明，m6A 能夠介導(dǎo)Notch 通路的激活來調(diào)控果蠅卵細(xì)胞的分裂和成熟。在家蠶中，干擾m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)會(huì)顯著降低細(xì)胞m6A 水平，同時(shí)，使細(xì)胞停滯在G1期而無法順利完成分裂[36]。

3 小結(jié)與展望

m6A 修飾廣泛存在于各種真核生物中。目前，研究較多的物種主要有酵母[3]、擬南芥[47]、斑馬魚[48]和小鼠[13]。在昆蟲中，m6A 的相關(guān)研究主要局限于雙翅目的果蠅，這可能與多年來果蠅研究中積累了較為完備的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、數(shù)據(jù)庫和調(diào)控通路模型有關(guān)。而m6A在其他昆蟲中的研究仍有很多空白，在不同種屬的昆蟲中開展相關(guān)研究將可能揭示m6A更多未知的調(diào)控功能或作用機(jī)制。

m6A 修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控的過程，并由特異性識(shí)別蛋白結(jié)合發(fā)揮下游調(diào)控功能，但其實(shí)際的調(diào)控過程很可能比已知的模型要復(fù)雜得多。一方面，m6A修飾在mRNA上的分布存在明顯的偏好性，這其中必然存在一定的機(jī)制來調(diào)整m6A 的分布以發(fā)揮特定的調(diào)控功能。例如在Sxl的可變剪接調(diào)控中，m6A 位點(diǎn)在被剪切的外顯子附近集中分布[18],說明m6A的位置與其調(diào)控功能相關(guān)，但決定m6A分布的機(jī)制及其分布改變對(duì)功能的影響尚有待明確。另一方面，對(duì)m6A調(diào)控酶的互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建仍有待完善，雖然Xio[39]、Zc3h13[49]、METTL16[50]等新的m6A調(diào)控酶相繼被發(fā)現(xiàn)，但依然存在很多未知的與m6A動(dòng)態(tài)調(diào)控有關(guān)的酶。例如在果蠅中，m6A 能夠被雙向調(diào)控，但并未發(fā)現(xiàn)果蠅的m6A去甲基化酶。這些酶如何參與m6A的調(diào)控過程，相互之間存在何種互作關(guān)系，對(duì)它們的功能產(chǎn)生什么樣的影響等問題尚有待明確。

m6A 能夠?qū)€(gè)體的多種生命活動(dòng)產(chǎn)生影響，但針對(duì)昆蟲的相關(guān)研究僅對(duì)m6A 影響果蠅性別分化和神經(jīng)發(fā)育的機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的闡述，m6A 在其他物種中的典型功能，如調(diào)控小鼠干細(xì)胞分化[46]和斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡[25]等，很可能在昆蟲中同樣存在。昆蟲具有與其他物種不同的變態(tài)發(fā)育方式，m6A 是否參與了這些發(fā)育過程的調(diào)控、不同物種之間的調(diào)控通路是否存在差異等都尚待研究。此外，m6A 還具有調(diào)控病害與宿主互作的功能[51]，如在家蠶中能夠影響桿狀病毒蛋白的表達(dá)[37]，但m6A 在其中發(fā)揮的具體作用和調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。從m6A的功能入手展開更系統(tǒng)和深入的研究，將有助于通過改造m6A 修飾水平或時(shí)空分布來培育具有更好的經(jīng)濟(jì)性狀或環(huán)境適應(yīng)和病害抵抗能力的經(jīng)濟(jì)昆蟲品種，也有助于開發(fā)能夠造成害蟲m6A調(diào)控紊亂的特異性藥物，從而為經(jīng)濟(jì)昆蟲繁育和害蟲生物防治提供新的思路，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。

總之，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，對(duì)m6A 功能和調(diào)控機(jī)制的研究已具有了豐富的知識(shí)積累，但在昆蟲方面的研究仍有很多空白，完善昆蟲m6A相關(guān)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，開發(fā)新的研究技術(shù)以及拓展對(duì)m6A生物學(xué)功能和作用機(jī)制的了解依然任重道遠(yuǎn)。