南京市1例暴露感染HIV病例的溯源調(diào)查

董瀟瀟 許文炯 喬夢(mèng)凱 毛子晴 張洪英 王燕 吳詠梅

作者單位：南京市疾病預(yù)防控制中心，江蘇，南京210003

艾滋?。ˋcquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的職業(yè)暴露是指工作人員在從事相關(guān)工作時(shí)被艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者/AIDS 病人（HIV/AIDS）的血液、體液污染了皮膚、粘膜，又或被含有HIV 的血液、體液污染的針頭等利器刺破皮膚，有被HIV 感染的風(fēng)險(xiǎn)［1］。AIDS 職業(yè)暴露涉及到醫(yī)療衛(wèi)生人員和人民警察，其中以醫(yī)療衛(wèi)生人員為主［2?3］。傳統(tǒng)的職業(yè)暴露后感染的認(rèn)定主要依賴于隨訪期內(nèi)暴露者HIV抗體是否發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)，而在某些特殊情況下，比如暴露者在暴露前、后6 個(gè)月內(nèi)發(fā)生過(guò)易感染HIV 的行為，或是在暴露時(shí)未按照職業(yè)暴露處置管理的感染的溯源認(rèn)定，則需要依賴分子流行病學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本市一例醫(yī)務(wù)人員曾被某HIV 感染者氣道分泌物污染了皮膚，暴露者在暴露后22 天檢測(cè)其HIV 抗體為陽(yáng)性，懷疑其為職業(yè)暴露后感染。本調(diào)查對(duì)其進(jìn)行了分子流行病學(xué)溯源檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及流行病學(xué)資料

醫(yī)務(wù)人員（以下簡(jiǎn)稱H），男，29 歲，曾在處置急診病人（暴露源病人，以下簡(jiǎn)稱S）時(shí)被其氣道分泌物噴濺至手前臂，污染部位皮膚無(wú)破損，并立即以清水沖洗污染的皮膚。當(dāng)時(shí)未按照職業(yè)暴露流程處置上報(bào)，不曾留取本底血清，也不曾服用藥物進(jìn)行暴露后預(yù)防。隨后S 的入院檢查結(jié)果顯示HIV 抗體初篩陽(yáng)性。暴露發(fā)生后的第22 天H 體檢顯示HIV 抗體篩查陽(yáng)性，H 否認(rèn)其他可能感染HIV 的高危行為，認(rèn)為暴露后感染的可能性最大。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采樣及血清學(xué)檢測(cè)

暴露后第22 天用EDTA 抗凝管采集H 和S全血6 mL，立即顛倒混勻，3 000 r/min 離心15 min 后分離血漿留存。參照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2020 修訂版）》［4］，首先進(jìn)行HIV 抗體篩查實(shí)驗(yàn)，試劑為Bio?Rad 人類(lèi)免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒第四代（酶聯(lián)免疫法，批號(hào)：0A0488）和Alere 人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗體檢測(cè)試劑盒（膠體硒法，批號(hào)：98806K100A）；初篩陽(yáng)性樣本進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，試劑為MP 人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV1+2）型抗體檢測(cè)試劑盒（免疫印跡法，批號(hào)：AE9029）。

1.2.2 核酸提取及目的片段擴(kuò)增

取200 μL 血漿，提取血漿中病毒RNA，使用醫(yī)脈賽全自動(dòng)核酸提取儀（EmagPure?96Plus）及配套試劑，提取方法參照試劑說(shuō)明書(shū)。提取的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR 及巢式PCR 的方法擴(kuò)增目的片段。目的片段包括HIV?1 聚合酶pol區(qū)、衣殼蛋白gag區(qū)及包膜蛋白env區(qū)基因片段。擴(kuò)增試劑由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)，擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 HIV?1 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 HIV?1 PCR primers

1.3 測(cè)序及序列分析

目的產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定無(wú)誤后，擴(kuò)增成功的HIV?1 pol 區(qū)、gag 區(qū)和env 區(qū)產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司公司純化并測(cè)序。反饋的基因序列使用Contig Express 校正和拼接，在美國(guó)洛斯阿拉莫斯國(guó)家實(shí)驗(yàn)室HIV 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hiv.lanl.gov）中比對(duì)，判斷基因亞型。利用Mega 軟件的Neighbor Joining 法針對(duì)不同目的基因?qū)⒋菰礃颖炯捌湎嗨菩蛄型髯詤⒖夹蛄蟹謩e構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)計(jì)算基因距離，其中pol 區(qū)加入5 個(gè)已知亞型的南京本土HIV 感染病例的序列作為對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將基因距離錄入Excel 表，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

H和S血清學(xué)結(jié)果均為HIV抗體陽(yáng)性；兩者補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)條帶基本一致，S比H多一條p39條帶。見(jiàn)表2。

表2 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Serological test results

2.2 基因亞型及距離

H 和S 兩份樣本均成功擴(kuò)增了HIV?1pol區(qū)、gag區(qū)和env區(qū)三個(gè)目的片段；三個(gè)區(qū)的基因亞型檢測(cè)結(jié)果，H 均為CRF01?AE 型，S 均為CRF07?BC亞型；pol 區(qū)、gag 區(qū)和env 區(qū)序列H 與S 的基因距離分別為0.135、0.187、0.319，均大于H 與其對(duì)應(yīng)相似株的基因距離，也大于S 與其對(duì)應(yīng)相似株的基因距離。見(jiàn)表3。

表3 基因亞型及基因距離Table 3 Gene subtype and gene distance

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

HIV?1 pol 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1 所示，樣本H 與CRF01?AE 參考亞型聚為一簇，判斷H 為CRF01?AE 亞型，而S 判為CRF?07BC 群。HIV?1 gag 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2，H 與CRF01AE 亞型參考序列聚在一起，而S 與CRF07BC 亞型參考序列聚成一簇。HIV?1 env 區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3，H 判定為CRF01AE 亞型，而S 與CRF07?BC、CRF08?BC 兩種亞型參考序列聚在一起，認(rèn)定其為BC 重組亞型。

圖1 溯源樣本HIV?1 pol 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree of HIV?1 pol region in traceable samples

圖2 溯源樣本HIV?1 gag 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of HIV?1 gag region in traceable samples

圖3 溯源樣本HIV?1 env 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of HIV?1 env region in traceable samples

3 討論

HIV 感染的溯源調(diào)查可以有效地確定傳染源，推測(cè)傳播途徑甚至明確傳播方向。以往的溯源多依賴于流行病學(xué)調(diào)查與追蹤［5］，而且流行病學(xué)調(diào)查對(duì)信息的準(zhǔn)確性和詳細(xì)度要求更高，也需要專業(yè)的訪談技巧。一旦出現(xiàn)被調(diào)查對(duì)象的不配合，線索有誤或中斷的情況，會(huì)影響調(diào)查結(jié)果，進(jìn)而影響溯源的可靠性［6?7］。

HIV 分子溯源技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)有疑似傳播關(guān)系的感染者體內(nèi)的HIV 病毒進(jìn)行同源性分析。HIV 病毒基因組為兩條單正鏈RNA，每條約9.7 kb。本次溯源調(diào)查分別擴(kuò)增了其中三個(gè)基因片段，包括編碼聚合酶前體蛋白的pol區(qū)，以及編碼衣殼蛋白和包膜蛋白gag區(qū)和env區(qū)。Pol區(qū)基因相對(duì)保守，通常用于分子流行病學(xué)的基因亞型檢測(cè)［8?9］，gag區(qū)和env區(qū)變異速度更快，在溯源性分析中應(yīng)用更多，尤其是包含高變異V3 環(huán)區(qū)的env基因區(qū)［10?12］。本次調(diào)查結(jié)果三個(gè)區(qū)的基因亞型結(jié)果互相符合，且不論是樣本H 或S 與各自相似株的基因距離還是H 與S 的基因距離，均為pol

本調(diào)查采用的PCR 產(chǎn)物Sanger 測(cè)序的方法，是將巢式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，流程相對(duì)簡(jiǎn)單，是HIV 分子溯源技術(shù)中最基礎(chǔ)的方法。在本研究結(jié)果從分子生物學(xué)角度，認(rèn)為兩者不存在傳播關(guān)系。直接測(cè)序法對(duì)于傳染源的確定具有很大的價(jià)值。然而判斷已知傳播關(guān)系的傳播方向或是獲得感染者體內(nèi)更多準(zhǔn)種的信息，則需要進(jìn)一步用到高通量測(cè)序的方法［14］。

在職業(yè)暴露的溯源鑒定中，擁有先進(jìn)的檢測(cè)手段可以提供客觀而真實(shí)的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，但職業(yè)暴露的規(guī)范化管理也顯得尤為重要。首先要不斷強(qiáng)化醫(yī)務(wù)人員的生物安全意識(shí)，定期宣傳培訓(xùn)，日常工作應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，采用合適的防護(hù)。尤其是在接觸高危人群/樣本，或是從事風(fēng)險(xiǎn)較高的操作時(shí)要提高警惕，萬(wàn)不可有僥幸心理。醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)有詳細(xì)的職業(yè)暴露應(yīng)急預(yù)案及處置流程，處理傷口的同時(shí)，也要及時(shí)登記上報(bào)評(píng)估，并做好追蹤工作［15］。該案例也提示，科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)防處置工作不僅可以提高職業(yè)暴露的溯源鑒定的效率，也可以降低暴露后感染HIV 的風(fēng)險(xiǎn)。