RLP76、Wip?1及Gal?9在子宮內(nèi)膜癌的表達及與細胞凋亡的相關(guān)性

王麗娜 史鳳菊 婁艷輝

作者單位：棗莊市山亭區(qū)人民醫(yī)院，山東，棗莊277100

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來該病發(fā)病率在世界各國均有增高趨勢，且發(fā)病年齡也呈年輕化發(fā)展，嚴(yán)重危害女性的生命健康［1］。RLP76 是Ras 超家族成員，定位于人18號染色體。國外文獻報道，RalA 可作為膜蛋白轉(zhuǎn)運體調(diào)控細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)體水平，調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡，與惡性腫瘤發(fā)生、進展相關(guān)［2］。野生型p53 誘導(dǎo)磷酸酶1（Wild type p53 inducible phosphatase 1，Wip?1）對p53 起負性調(diào)控作用，誘導(dǎo)p53 突變。已有文獻證實，Wip?1與子宮內(nèi)膜癌增殖、凋亡有關(guān)［3］。半乳凝素?9（Galectin?9，Gal?9）可通過抑制T 細胞活化和增殖負性調(diào)控機體免疫應(yīng)答，其與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系研究較多［4］，但尚未有明確定論。本研究旨在探討RLP76、Wip?1及Gal?9 在子宮內(nèi)膜癌的表達情況，以期為臨床開展子宮內(nèi)膜癌機制研究提供基礎(chǔ)資料，現(xiàn)研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年12月至2016年12月在本院收治的64 例子宮內(nèi)膜癌患者（共64 份子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本）作為子宮內(nèi)膜癌組。平均年齡（56.41±5.74）歲；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynaecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期［5］：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)手術(shù)或?qū)嶒炇覚z查確診為子宮內(nèi)膜癌［6］；②均為初次確診子宮內(nèi)膜癌的患者，納入研究前未接受放化療治療；③無手術(shù)禁忌癥；④所有患者均已簽署知情同意書；⑤本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過（QDDXFSYY?2017015）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神病史者；②合并其他婦科惡性腫瘤、其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；③復(fù)發(fā)或已接受過其他治療的子宮內(nèi)膜癌和患者。

選取同期在本院進行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜不典型增生患者68 例（共68 份子宮內(nèi)膜不典型增生標(biāo)本）設(shè)為對照組。平均年齡（56.21±5.66）歲。2 組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 RLP76 及Gal?9 檢測方法

采用S?P 免疫組化染色。將子宮內(nèi)膜癌組、對照組標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫水。RLP76、Gal?9兔多克隆抗體均采購自美國Epitomics 公司。免疫組化染色結(jié)果判定［7］：結(jié)合陽性細胞百分比和染色強度判定對結(jié)果進行判定。陽性細胞百分比為0 計0 分，≤10%計1 分，>10%～25%計2分，>25%～50%計3 分，>50%計4 分；細胞質(zhì)無染色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；兩項評分之和≤2 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.2.2Wip?1表達量檢測方法

采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測。取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的ECC?1 和KLE 細胞，加入細胞裂解液，按照Trizol 總RNA 提取試劑盒說明對總RNA 進行提取，并檢測純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA 為模板，按照PCR 試劑盒要求進行PCR。wip?1引物：上游5′?GTT CGT AGCAAT GCC TTC TCA?3′，下游5′?CAC TTT CTT GGG CTTTCA TTT G?3′；β?actin 引物：上游5′?CAC TGT GTT GGCGTA CAG GTC T?3 7，下游5′?GCG AGA TGA CCC AGATcA T?3′。PCR反應(yīng)條件：94℃2 min；92℃60 S，56℃30 S，74℃30 s，連續(xù)進行38 個循環(huán)。每份樣品均設(shè)置3 個平行反應(yīng)復(fù)孔。根據(jù)Lipofectimane 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將細胞進行轉(zhuǎn)染，分為抑制組、陰性對照組、空白對照組。Wipr1 siRNA 組細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip?1siRNA 質(zhì)粒，Wip?1特異性siRNA 靶序列：5′?CCA ATG AAG ATGAGT TAT G?3′ i。siRNA 對照組細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip?1siRNA 基因無同源性的陰性對照序列：5′?CTG GAC TTT CAG AAG AACA?3′。空白對照組細胞轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。以內(nèi)參為參考，用2?△△Ct法獲得子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本和子宮內(nèi)膜不典型增生組織及抑制組、陰性對照組、空白對照組中Wip?1表達量。Wip?1：≧1.8 視為異常增高［6］。

1.2.3 隨訪

以電話隨訪及門診復(fù)查的方式對患者隨訪4年，隨訪截止時間2020年12月，了解患者預(yù)后情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；計數(shù)資料通過n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 直線相關(guān)分析RLP76、Gal?9 及Wip?1與子宮內(nèi)膜癌患者細胞凋亡的相關(guān)性；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者RLP76、Gal?9及Wip?1表達情況比較

子宮內(nèi)膜癌組RLP76 和Gal?9 陽性率及Wip?1表達量均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組患者RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況比較［（n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene in two groups［（n（%），（±s）］

表1 兩組患者RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況比較［（n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene in two groups［（n（%），（±s）］

分組子宮內(nèi)膜癌組對照組t/χ2值P 值n Wip?1 64 68 RLP76陽性51（79.69）35（51.47）11.562<0.001陰性13（20.31）33（48.53）Gal?9陽性49（76.56）30（44.12）14.443<0.001陰性15（13.44）38（55.88）2.40±0.19 1.48±0.15<0.001

2.2 子宮內(nèi)膜癌組患者RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況與病理特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者RLP76 和Gal?9 陽性率及Wip?1表達量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌組患者RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況與病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 the relationship between the expression of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene and pathological features in endometrial carcinoma［n（%），（±s）］

表2 子宮內(nèi)膜癌組患者RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況與病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 the relationship between the expression of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene and pathological features in endometrial carcinoma［n（%），（±s）］

病理指標(biāo)χ2值P 值χ2值P 值Wip?1 t 值P 值年齡（歲）0.002 0.960 0.4760.490 0.957 0.342病理分級1.121 0.290 0.0250.875 1.292 0.201 FIGO 分期≧50<50Ⅰ～ⅡⅢ～ⅣⅠ～ⅡⅢ～Ⅳ3.274 0.070 0.3720.542 0.873 0.386組織學(xué)分級G1 2.098 0.148 0.1610.688 1.160 0.321淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移G2 G3有無例數(shù)（n=64）25 39 33 31 30 34 17 26 21 40 24 RLP76陽性（n=51）20（39.22）31（60.78）28（54.90）23（45.10）21（41.18）30（58.82）12（23.53）19（37.25）20（39.22）37（72.55）14（27.45）陰性（n=13）5（38.46）8（61.54）5（38.46）8（61.54）9（69.23）4（30.77）5（38.46）7（53.85）1（7.69）3（23.08）10（76.92）10.818 0.001 Gal?9陽性（n=49）18（36.73）31（63.25）25（51.02）24（48.95）24（48.95）25（51.02）9（18.37）20（40.82）20（40.82）35（71.43）14（28.57）陰性（n=15）7（46.67）8（53.33）8（53.33）7（46.67）6（40.00）9（60.00）8（53.33）6（60.00）1（6.67）5（33.33）10（66.67）7.1110.008 2.02±0.42 1.92±0.40 1.95±0.46 2.11±0.53 2.07±0.39 2.16±0.43 1.93±0.32 2.02±0.35 2.11±0.41 2.64±0.27 1.93±0.15 11.811<0.001

2.3 不同轉(zhuǎn)染組細胞中RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況比較

抑制組RLP76、Gal?9 及Wip?1表達量顯著高于陰性對照組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同轉(zhuǎn)染組細胞中RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene in different transfection groups（±s）

表3 不同轉(zhuǎn)染組細胞中RLP76、Gal?9 及Wip?1 表達情況比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates of rlp76，Gal?9 and wip?1 gene in different transfection groups（±s）

注：與抑制組比較，aP<0.05。

組別抑制組陰性對照組空白對照組F 值P 值RLP76 33.25±3.29 14.16±3.12a 13.88±2.99a 802.430<0.001 Gal?9 38.64±3.41 15.31±2.93a 14.93±2.80a 1262.290<0.001 Wip?1 17.85±1.18 5.14±0.40a 5.37±0.52a 5571.160<0.001

2.4 RLP76、Gal?9 及Wip?1 與子宮內(nèi)膜癌組患者細胞凋亡率的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性顯示，RLP76（r=0.781）、Gal?9（r=0.773）及Wip?1（r=0.836）與子宮內(nèi)膜癌組患者細胞凋亡率呈正相關(guān)（P<0.05）。

2.5 RLP76、Gal?9 及Wip?1 與子宮內(nèi)膜癌組患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后四年死亡率為65.63%（42/64）。RLP76 陽性、Gal?9 陽性及Wip?1高表達的患者死亡率顯著高于RLP76 陰性、Gal?9 陰性及Wip?1低表達的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 RLP76、Gal?9 及Wip?1 與子宮內(nèi)膜癌組患者預(yù)后的關(guān)系［n（%）］Table 4 Relationship between rlp76，Gal?9，wip?1 gene and prognosis of endometrial carcinoma［n（%）］

3 討論

盡管近年來診療子宮內(nèi)膜癌的手段已得到顯著進步，但患者5年預(yù)后生存率仍較低。腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差的主要原因，隨著疾病的進展及細胞內(nèi)相關(guān)基因表達的變化，細胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致宮頸上皮細胞平衡被破壞從而引發(fā)癌變。尋找參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的有效標(biāo)志物對評估子宮內(nèi)膜癌患者病情進展、預(yù)后具有重要參考價值。

RLP76 調(diào)控細胞生長、遷移、分裂和凋亡，主要表達于乳腺、心臟、肝臟和紅細胞中。Ngoi N 等學(xué)者［8］研究指出，RLP76 在腫瘤組織中表達異常增高，在多種信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用，參與細胞增殖、遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中RLP76陽性表達率顯著高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織標(biāo)本，且RLP76 陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險更大，進一步證實上述觀點。本研究還發(fā)現(xiàn)抑制組RLP76 細胞凋亡率高于陰性對照組和空白對照組，與既往文獻報道結(jié)果一致［9］，提示RLP76 可促使子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡?？紤]為RLP76 通過上調(diào)凋亡抑制因子表達、抑制凋亡相關(guān)基因表達，從而使子宮內(nèi)膜癌細胞躲避凋亡程序，實現(xiàn)異常增殖所致。

大量研究證實，Wip?1能夠通過直接或間接路徑使抑癌基因p53磷酸化進程被抑制，從而使p53失活，給腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了有利環(huán)境［10］。相關(guān)研究報道，在甲狀腺癌、小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌組織中，Wip?1呈高表達狀態(tài)，與惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期有顯著相關(guān)性，高表達的Wip?1可打破機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，影響p53 活性，促進腫瘤發(fā)生、細胞凋亡［11］。

Gal?9 蛋白在細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)及細胞核內(nèi)均有分布，研究表明，前列腺癌、腎癌、胃癌等多種癌組織中層強陽性表達［12］。Joly 等學(xué)者［13］報道Gal?9 蛋白在宮頸上皮細胞不典型增生至癌變過程中凸顯重要作用。國內(nèi)學(xué)者報道，Gal?9 可誘導(dǎo)胸腺細胞、T 細胞及巨噬細胞的凋亡，同時對腫瘤細胞凋亡、轉(zhuǎn)移等發(fā)揮了一定作用，與本研究得出結(jié)果一致［14］。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，RLP76、Gal?9蛋白及Wip?1與子宮內(nèi)膜癌組患者細胞凋亡率呈正相關(guān)。提示，隨著細胞凋亡的發(fā)生，RLP76、Gal?9蛋白及Wip?1表達量逐漸升高。表明子宮內(nèi)膜癌患者在對抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，可能受到RLP76、Gal?9 蛋白及Wip?1等因素的影響，導(dǎo)致細胞凋亡、增殖的平衡被打破［15］。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中RLP76、Gal?9 蛋白及Wip?1表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且與細胞凋亡率呈正相關(guān)。提示三者對子宮內(nèi)膜癌患者細胞凋亡產(chǎn)生影響，對明確子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有重要評估價值，檢測RLP76、Gal?9 蛋白及Wip?1可為臨床評估病情進展和診療效果提供可靠依據(jù)。后續(xù)筆者將擴大樣本量，進一步分析子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程。