生髓健骨膠囊對(duì)酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響

任樹軍 于長(zhǎng)江 梁彥林 杜海月 李遠(yuǎn)峰 徐西林

酒精性骨質(zhì)疏松癥是指由于長(zhǎng)期酗酒影響骨的形成與代謝，導(dǎo)致骨量、骨密度及骨礦含量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞及骨力學(xué)性能下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]。由于長(zhǎng)期大量飲酒后引起骨質(zhì)疏松癥早期階段骨密度沒有明顯改變，而影響骨代謝的生化指標(biāo)如血清鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素(BGP)的變化通常在全身骨質(zhì)疏松之前發(fā)生[2]，因此明確骨代謝指標(biāo)的變化對(duì)于延緩骨量丟失、防止酒精性骨質(zhì)疏松有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過建立酒精性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，研究生髓健骨膠囊對(duì)酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶及骨鈣素等生化代謝變化的影響，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠120只，體質(zhì)量(220±20)g，健康成年清潔級(jí)，來自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(黑) 20170103。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

生髓健骨膠囊 (規(guī)格為0.35 g/粒，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，批準(zhǔn)文號(hào)為黑衛(wèi)藥制字Z20110036)；阿法D3(規(guī)格0.25 μg/粒，以色列TEVA制藥工業(yè)有限公司制造，昆明貝克諾頓制藥(KBN)有限公司分裝，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字J20130162)；碳酸鈣片(規(guī)格為500 mg/片，吉林萬(wàn)通藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H10980201)；白酒(牛欄山白酒56度，規(guī)格500 mL/瓶，北京順鑫公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB/T10781.2，生產(chǎn)許可證號(hào)SC11511130712623)；0.9%NaCl注射液(規(guī)格500 mL/袋，華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H11021490) 。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)生化分析儀(山東博科儀器有限公司，型號(hào)規(guī)格為BK-200)測(cè)定血清鈣、磷、堿性磷酸酶的含量，RIA法測(cè)定骨鈣素含量。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1造模方法 參照文獻(xiàn)[3-4]將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱大鼠體質(zhì)量，分為四組(模型組、空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組、中藥干預(yù)組)，每組各30只，分籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)大鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

造模采用白酒灌胃法。用白酒按SD大鼠體質(zhì)量10 mL/(kg·d)的劑量灌胃，1次/d，干預(yù)8、12、16 周后取材。觀察大鼠進(jìn)食、飲水、毛色光澤度、精神狀態(tài)以及二便的性狀色澤等，以調(diào)整酒精的用量。每周對(duì)大鼠體質(zhì)量測(cè)量1次，最后1次灌胃后開始禁食水，12 h后采集標(biāo)本，檢測(cè)指標(biāo)為血清鈣、磷、堿性磷酸酶及骨鈣素。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)方法 模型組：每日早上按大鼠體質(zhì)量，4.4 g/kg 10 mL的白酒劑量灌胃。下午用等量的0.9%NaCl注射液灌胃，1次/d。

空白對(duì)照組：每日早上和下午用等量0.9%NaCl注射液灌胃，2次/d。

中藥干預(yù)組：每日早上用白酒灌胃，劑量跟模型組保持一致。下午用生髓健骨膠囊配成混懸液灌胃給藥，劑量按大鼠體質(zhì)量確定，4.7 g/kg 10 mL劑量，1次/d。

西藥對(duì)照組：每日早上與模型組保持一致，用同等劑量白酒灌胃。下午用碳酸鈣和阿法D3混懸液灌胃(其中阿法D3按大鼠體質(zhì)量確定，0.05 μg/kg 10 mL，碳酸鈣片按大鼠體質(zhì)量確定，85 mg/kg 10 mL劑量，分別與0.9%NaCl注射液配成混懸液，每日劑量是成人等效劑量的10倍)，1次/d。各組大鼠均用標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，灌胃用藥持續(xù)16周，期間自由進(jìn)食水。每周稱1次體質(zhì)量，根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化再調(diào)整藥量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進(jìn)行組間單因素ANOVA方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠8周末血清生化結(jié)果的比較見表1。各組大鼠12周末血清生化結(jié)果的比較見表2。各組大鼠16周末血清生化結(jié)果的比較見表3。

表1 各組大鼠8周末血清生化指標(biāo)比較

表2 各組大鼠12周末血清生化指標(biāo)比較

表3 各組大鼠16周末血清生化指標(biāo)比較

造模干預(yù)8、12、16周末血清生化檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果：模型組的血清Ca、P、ALP及BGP與空白對(duì)照組相比均有不同程度的下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥干預(yù)組和西藥對(duì)照組的Ca、P、ALP及BGP分別與模型組相比明顯升高(P<0.01，P<0.05)，且中藥干預(yù)組效果優(yōu)于西藥對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

酒精性骨質(zhì)疏松癥是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致骨代謝異常，成骨減少而破骨增加，從而使骨量丟失，骨強(qiáng)度減低，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。酒精性骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)的“骨痹、骨痿、骨枯”范疇，其病機(jī)為氣血陰陽(yáng)俱虛，以腎虛為主，兼有脾氣虧虛，肝陰不足。生髓健骨膠囊化裁自鹿角膠丸，其原方載于《醫(yī)學(xué)正傳》[5]。該方由熟地黃、鹿角膠、龜板、龍骨、當(dāng)歸、白術(shù)、葛根等中藥材研制而成。方中鹿角膠長(zhǎng)于溫補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血；龜板善于益腎強(qiáng)骨，滋陰潛陽(yáng)，兩者合用“為血肉有情之品，補(bǔ)陰陽(yáng)而化生精血之佳品”[6]，以補(bǔ)腎壯骨、填精生髓，共為君藥。生黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、白術(shù)健脾益氣、滋陰養(yǎng)血，培補(bǔ)后天生化之源故為臣。葛根、丹參、郁金、地龍、牛膝解除酒毒，化瘀止痛、涼血活血、行氣通絡(luò)共為佐藥；其中葛根含有的葛根素能有效抑制腸道對(duì)酒精的吸收，黃體酮類物質(zhì)可刺激存在于肝內(nèi)的P450酶活性，加快酒精及其代謝產(chǎn)物的清除[7]；牛膝中的脫皮甾酮能夠明顯促進(jìn)原代培養(yǎng)去卵巢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，起到很好的抗骨質(zhì)疏松作用[8]。龍骨、牡蠣固精壯骨，平肝潛陽(yáng)合為使藥。此方不但具有補(bǔ)腎健脾、強(qiáng)健筋骨的作用，而且還能夠在補(bǔ)腎健脾的同時(shí)養(yǎng)肝血、滋腎陰、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛，達(dá)到了標(biāo)本兼治的效果[9-10]，適用于酒精性骨質(zhì)疏松癥的病機(jī)。

本課題前期研究表明生髓健骨膠囊可明顯改善酒精性骨質(zhì)疏松大鼠股骨生物力學(xué)的性能，提高骨硬度和骨彈性[11]；提高大鼠骨密度，增加骨礦含量，抑制礦物質(zhì)丟失，改善大鼠的骨代謝，從而達(dá)到防治酒精性骨質(zhì)疏松癥的目的[12]。最近的研究提示生髓健骨膠囊可通過激活 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來干預(yù)β-catenin及LRP5含量的上調(diào)，下調(diào)PPARγ2含量來抑制其過氧化作用的損傷，促進(jìn)成骨分化，抑制破骨細(xì)胞的吸收作用，防治酒精性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[13]?，F(xiàn)旨在研究生髓健骨膠囊對(duì)酒精性骨質(zhì)疏松大鼠骨形成及骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響，能否減少骨量丟失，抑制破骨從而達(dá)到治療目的。血清中鈣和磷可以反映全身骨質(zhì)代謝的狀況，是衡量骨礦化的重要指標(biāo)。充足的鈣、磷是保證骨強(qiáng)度的物質(zhì)基礎(chǔ)，成骨和破骨作用需要骨骼中的鈣、磷與血清中的鈣、磷不斷進(jìn)行交換才能維持動(dòng)態(tài)平衡[14-15]。骨鈣素是有成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌合成的一種特殊非膠原蛋白，骨鈣素可與鈣和羥磷灰石結(jié)合，是骨礦化的必需成分。所以血清中骨鈣素濃度能特異性地反映成骨細(xì)胞的活性，可以用來判斷成骨細(xì)胞活性受抑制的程度，是骨形成功能良好的標(biāo)志[16-17]。在成骨活躍時(shí)，成骨細(xì)胞會(huì)分泌大量的堿性磷酸酶，它是一種成骨化的特異性蛋白，可調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生。因此同樣可以直接反映成骨細(xì)胞的活性或功能狀態(tài)，亦與鈣、磷的代謝密切相關(guān)[18-19]。酒精性骨質(zhì)疏松的主要診斷指標(biāo)是骨密度，但是骨密度測(cè)量結(jié)果往往滯后于骨質(zhì)代謝的實(shí)際情況。生髓健骨膠囊對(duì)血清中鈣、磷、骨鈣素和堿性磷酸酶的調(diào)節(jié)可改善機(jī)體骨代謝的狀態(tài)，增加骨吸收，提高骨密度，為臨床治療酒精性骨質(zhì)疏松提供合適的方法，即盡早治療效果會(huì)更好，這也與前期的研究具有高度的一致性。

本研究表明：生髓健骨膠囊可以提高酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清中鈣、磷、堿性磷酸酶及骨鈣素含量，改善大鼠的骨代謝，減少破骨作用和緩解骨量丟失，從而達(dá)到防治酒精性骨質(zhì)疏松癥的目的。存在的不足之處是本實(shí)驗(yàn)主要研究生化指標(biāo)且觀察期較短，今后可增加藥理學(xué)指標(biāo)及分子層面的驗(yàn)證和延伸研究，進(jìn)一步明確生髓健骨膠囊防治酒精性骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。