生骨再造丸對(duì)激素性股骨頭壞死兔骨髓組織中微小RNA-708表達(dá)的影響

曹林忠 鄔明峻 蔣瑋 王多賢 張琪 劉孟初 馬學(xué)強(qiáng)

激素性股骨頭壞死(SANFH)是由于臨床中糖皮質(zhì)激素(GC)不規(guī)范使用或長(zhǎng)期大量應(yīng)用而引起的嚴(yán)重骨科疾病[1]。SANFH是治療比較困難的一種骨關(guān)節(jié)疾病，沒(méi)有及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療導(dǎo)致股骨頭塌陷后會(huì)引發(fā)髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，致使患者生活質(zhì)量降低，社會(huì)及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重。GC引起的BMSCs成骨-成脂分化失衡是SANFH發(fā)生的主要機(jī)制之一[2]，miRNA-708在GC相關(guān)疾病及多種骨科疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)表明miRNA-708在SANFH患者股骨頭組織中呈過(guò)表達(dá)，GC可導(dǎo)致BMSCs的miRNA-708表達(dá)水平增高[3]。但GC損傷機(jī)體骨組織分子機(jī)制不明確，臨床尚未發(fā)現(xiàn)有效治療藥物。因此，如何有效阻斷SANFH的進(jìn)展，促進(jìn)受損股骨頭組織的恢復(fù)，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，中醫(yī)藥防治SANFH取得了較好的臨床療效，生骨再造丸治療早期SANFH療效顯著，但其確切的作用機(jī)制及更有效的治療方法仍是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)[4]。本實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證SANFH的發(fā)生與miRNA-708的相關(guān)性，明確生骨再造丸是通過(guò)抑制miRNA-708的表達(dá)以阻斷SANFH的進(jìn)展，從而為中醫(yī)藥防治SANFH提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2.5個(gè)月齡健康普通級(jí)新西蘭大白兔，50只，雄性，1.8～2.2 kg，西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(川)2018-17。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

生骨再造丸(170803，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)；仙靈骨葆膠囊 (190106，國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂制藥有限公司)；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(X60842，Pfizer Manufacturing Belgium NV)；LPS(1001164401，SIGMA)；注射用青霉素鈉(F8122301，華北制藥股份有限公司)；L-DMEM培養(yǎng)基(CGM103.05，Cellmax)，H-DMEM培養(yǎng)基(CGM102.05，Cellmax)，堿性磷酸酶顯色試劑盒(MA0197，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，OriCell，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(RBXMX-90021，廣州賽業(yè)生物)，油紅O染色試劑盒(G1261，北京索萊寶)，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(638313，Clontech)，流式抗體CD29(bs-0486R-PE)、CD34(bs-0646PE-cy7)、CD44(bs-2507R-APC)、CD45(bs-0522R-FITC)均購(gòu)自北京博奧森；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(RR920A，Takara)，miRNA-708-3p、miRNA-708-5p引物交由Takara公司設(shè)計(jì)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

生物超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈安泰公司)；搖床(北京六一儀器廠)；離心機(jī)(BECKMAN COULTER)；梯度PCR儀(Biometra)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Roch)。

1.4方法

1.4.1造模方法 實(shí)驗(yàn)組采用LPS聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉法造模[5]，耳緣靜脈注射LPS(10 μg/kg)、臀肌注射甲潑尼龍琥珀酸鈉(20 mg/kg)，1次/d，共3次，臀肌處注射青霉素以預(yù)防感染。空白組給予耳緣靜脈與臀肌注射等量生理鹽水和青霉素。28 d后MRI驗(yàn)證造模成功。

1.4.2分組方法 將50只普通級(jí)新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10只，實(shí)驗(yàn)組40只，實(shí)驗(yàn)組造模成功32只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組10只，仙靈骨葆組11只，生骨再造丸組11只(兔的藥物灌胃為有創(chuàng)操作，操作不當(dāng)會(huì)引起死亡，導(dǎo)致藥物干預(yù)失敗，根據(jù)實(shí)際造模情況，藥物組模型數(shù)量為11只)。

1.4.3干預(yù)方法 仙靈骨葆組以0.4 g/kg仙靈骨葆、生骨再造丸組以0.6 g/kg生骨再造丸灌胃28 d[6]，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃。

1.4.4標(biāo)本制作方法 藥物干預(yù)28 d后，仙靈骨葆組和生骨再造丸組各選取灌胃成功的10只，空氣栓塞法處死，取出兩側(cè)股骨。Percoll法分離各組BMSCs，完全沖出骨髓，重懸、離心，棄上清，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液重懸，鋪于等量的Percoll分離液上，離心吸取白膜層，洗滌2次，棄上清；酶消法分離各組OB，將分離處理好的股骨頭碾碎，加入適量胰蛋白酶，恒溫?fù)u床中預(yù)消化后離心，棄上清，加入3～5 mL 0.1%Ⅰ型膠原酶，恒溫?fù)u床中消化后離心，棄上清；密度梯度離心法分離各組脂肪細(xì)胞，將股骨從中間剪斷，完全沖出骨髓，重懸、離心，吸取上層脂肪層；提取的BMSCs、OB、脂肪細(xì)胞加入5 mL H-DMEM完全培養(yǎng)基，移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)換液。

1.5實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.5.1BMSCs、OB和脂肪細(xì)胞的鑒定 各組P1代BMSCs、OB培養(yǎng)至約90%融合時(shí)流式細(xì)胞技術(shù)鑒定，培養(yǎng)至約90%融合時(shí)再誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2～3周，BMSCs用堿性磷酸酶染色鑒定，OB用茜素紅染色鑒定。初代脂肪細(xì)胞用油紅O染色鑒定。

1.5.2qRT-PCR檢測(cè)miRNA-708-3p和miRNA-708-5p 各組P1代90%融合的BMSCs、OB和初代脂肪細(xì)胞中加入MagZolTMReagent提取并測(cè)定各組細(xì)胞總RNA，miRNA按照試劑盒說(shuō)明步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)miRNA-708-3p和miRNA-708-5p表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1MRI驗(yàn)證結(jié)果

造模28 d，隨機(jī)抽取8只行MRI驗(yàn)證，股骨頭關(guān)節(jié)面及關(guān)節(jié)間隙正常，股骨頭前上部T1WI為低信號(hào)、T2WI為高信號(hào)(見(jiàn)圖1)。

圖1 造模后影像資料

2.2BMSCs、OB、脂肪細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.2.1BMSCs鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：CD29及CD44結(jié)果表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為為100%、99.5%；CD34及CD45結(jié)果表達(dá)陰性，陰性率分別為98.9%、97.0%(見(jiàn)圖2)。對(duì)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后BMSCs行堿性磷酸酶染色，鏡下觀察BMSCs呈現(xiàn)藍(lán)紫色(見(jiàn)圖3)。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD29、CD44及CD34、CD45流式檢測(cè)結(jié)果

圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶染色(×100)

2.2.2OB鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：鈣粘蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率98.37%；CD45表達(dá)陰性，陰性率99.97%(見(jiàn)圖4)。茜素紅染色：鏡下可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖5)。

圖4 成骨細(xì)胞鈣粘蛋白、CD34流式檢測(cè)結(jié)果

圖5 成骨細(xì)胞茜素紅染色(×100)

2.2.3脂肪細(xì)胞鑒定結(jié)果 油紅O染色：鏡下見(jiàn)橘紅色脂肪細(xì)胞(見(jiàn)圖6)。

圖6 脂肪細(xì)胞油紅O染色(×100)

2.3qRT-PCR檢測(cè)miRNA-708在各組BMSCs、OB、脂肪細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3.1miRNA-708-3p在各組細(xì)胞中的表達(dá)

1)BMSCs：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組對(duì)比生骨再造丸組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miRNA-708-3p的表達(dá)

2)OB：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組對(duì)比生骨再造丸組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8 各組成骨細(xì)胞中miRNA-708-3p的表達(dá)

3)脂肪細(xì)胞：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組對(duì)比模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖9。

圖9 各組脂肪細(xì)胞中miRNA-708-3p的表達(dá)

2.3.2miRNA-708-5p在各組細(xì)胞中的表達(dá)

1)BMSCs：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；生骨再造丸組對(duì)比仙靈骨葆組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，見(jiàn)圖10。

圖10 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miRNA-708-5p的表達(dá)

2)OB：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；生骨再造丸組對(duì)比仙靈骨葆組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖11。

圖11 各組成骨細(xì)胞中miRNA-708-5p的表達(dá)

3)脂肪細(xì)胞：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組對(duì)比模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖12。

圖12 各組脂肪細(xì)胞中miRNA-708-5p的表達(dá)

3 討論

GC導(dǎo)致SANFH已成為臨床共識(shí)，GC作為抗炎藥被長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床是引起SANFH的重要原因。GC結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)可顯著影響細(xì)胞代謝、存活、增殖和分化[7]。GR介導(dǎo)的信號(hào)可由miRNA-708啟動(dòng)子區(qū)域響應(yīng)，從而引起細(xì)胞的一系列反應(yīng)[8]。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)小內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，約含有19～23個(gè)核苷酸，可與目標(biāo)mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，最新研究表明miRNA相關(guān)制劑有可能成為新的治療藥物[9]。miRNA在細(xì)胞分化、凋亡的過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明miRNA可調(diào)控骨代謝過(guò)程，是SANFH進(jìn)展的重要因素。miRNA-708起最初被認(rèn)為是一種可能的抑癌基因，miRNA-708的過(guò)表達(dá)可調(diào)節(jié)黏附分子和誘導(dǎo)骨髓分化，miRNA-708通過(guò)調(diào)控下游效應(yīng)來(lái)影響關(guān)鍵基因，從而影響組織的自我更新及細(xì)胞的增殖、分化和死亡[10]。

Hao等[3]發(fā)現(xiàn)SANFH患者股骨頭組織中miRNA-708高表達(dá)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)GC可導(dǎo)致BMSCs中miRNA-708高表達(dá)。成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)和SMAD3可協(xié)同調(diào)節(jié)骨代謝。miRNA-708通過(guò)結(jié)合mRNA3’非翻譯區(qū)(3′-UTR)調(diào)控SMADs激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路，TGF-β介導(dǎo)SMAD3在RUNX2基因處聚集，從而抑制或激活下游靶基因可調(diào)節(jié)蛋白形成。

miRNA-708-5p和miRNA-708-3p同源于前體miRNA-708，對(duì)骨質(zhì)疏松癥(OP)的發(fā)生具有協(xié)同作用。miRNA-708-5p和miRNA-708-3p在卵巢切除(OVX)大鼠和OP患者骨組織中均有高表達(dá)。miRNA-708-5p通過(guò)靶向介導(dǎo)SMAD特異性E3泛素蛋白連接酶-2對(duì)BMSCs的成骨細(xì)胞分化產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，而miRNA-708-3p通過(guò)靶向結(jié)合小腦變性相關(guān)蛋白-1的翻譯RNA對(duì)骨髓單核細(xì)胞中破骨細(xì)胞的分化調(diào)控[11]。Wu等[12]在膠原誘導(dǎo)的大鼠RA模型中注射miRNA-708-5p可以改善RA指數(shù)，降低Wnt3a/β-catenin在大鼠關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-708-5p能誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A凋亡，明顯抑制細(xì)胞集落形成和遷移、Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS聯(lián)合GC成功復(fù)制SANFH的模型，發(fā)現(xiàn)模型組BMSCs和OB細(xì)胞中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表達(dá)量較空白組明顯升高，表明miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的上調(diào)參與了SANFH的發(fā)生。

生骨再造丸基于中醫(yī)整體觀念，以通陽(yáng)、利濕、活血法立方，組方以淫羊藿、桂枝、黃芪、三七、澤瀉等為主。方中君藥淫羊藿、鹿角膠、骨碎補(bǔ)滋補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；臣藥黃芪、桂枝補(bǔ)益脾肺之氣，配合利濕之澤瀉，活血化瘀之丹參、三七、龍血竭、山楂等佐使藥以通血脈，全方共奏通陽(yáng)、利濕、活血之功。藥理學(xué)研究表明，淫羊藿總黃酮可抑制核因子κB(Nuclear Factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路的激活從而減少促炎因子表達(dá)和炎性浸潤(rùn)[13]。鹿角膠、骨碎補(bǔ)可補(bǔ)血活血、抗炎鎮(zhèn)痛，預(yù)防骨質(zhì)疏松[14-15]。黃芪多糖可降低細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的分泌，促進(jìn)BMSCs的增殖分化[16]，桂枝可發(fā)揮抗炎免疫作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[17]。其余利濕活血藥物可改善股骨頭微循環(huán)和促進(jìn)骨愈合的療效亦被證實(shí)。生骨再造丸治療早、中期激素性股骨頭壞死療效確切[18]，低劑量生骨再造丸可顯著改善模型大鼠的血脂水平、骨代謝水平、抑制炎癥細(xì)胞因子，改善股骨頭骨小梁密度水平及骨礦物含量，從而延緩SANFH的進(jìn)展[6，19-20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)生骨再造丸干預(yù)后SANFH中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表達(dá)量明顯降低，表明生骨再造丸通過(guò)降低miRNA-708的表達(dá)以治療SANFH。

綜上所述，miRNA-708在GC誘導(dǎo)的股骨頭壞死中發(fā)揮著重要作用，生骨再造丸靶向下調(diào)BMSCs和OB中miRNA-708表達(dá)水平是治療SANFH的主要機(jī)制之一。但生骨再造丸進(jìn)入體內(nèi)代謝后通過(guò)哪種信號(hào)通路下調(diào)miRNA-708的表達(dá)水平以及miRNA-708靶向抑制哪種下游關(guān)鍵蛋白或相關(guān)信號(hào)通路，從而起到抑制SANFH的作用，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。