銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布及其序列特征分析

范雪嬌，汪貴斌，楊曉明，周婷婷，任 重

（南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037）

銀杏Ginkgo bilobaL.為銀杏科銀杏屬植物，起源于古生代晚期，至今已有2.7 億～3.5 億年的演化歷史，在經(jīng)歷過第四冰期后，銀杏僅在我國殘存，后被引種至其他國家，銀杏是世界著名的中生代孑遺植物，也被譽(yù)為植物界的“活化石”，其種質(zhì)資源十分珍貴[1-5]。銀杏為落葉大喬木，雌雄異株，又被稱為白果樹、公孫樹。銀杏的用途十分廣泛，目前，銀杏在食用、觀賞、生態(tài)防護(hù)、經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療保健及科學(xué)研究等方面都具有很高的應(yīng)用價(jià)值，尤其是銀杏的藥用價(jià)值已在世界范圍內(nèi)受到關(guān)注[6-8]。2015—2019年，浙江大學(xué)、中國科學(xué)院植物研究所和華大基因研究院的科學(xué)家們在構(gòu)建了銀杏首個(gè)基因組草圖后對全球545 棵銀杏大樹進(jìn)行了基因組重測序，2019年終于構(gòu)建了迄今為止最大的銀杏遺傳數(shù)據(jù)庫，這為認(rèn)識(shí)銀杏的進(jìn)化歷史與進(jìn)化潛力提供了重要信息[9]。曾有學(xué)者研究了如何利用ISSR 分子標(biāo)記來分析銀杏種質(zhì)資源的遺傳多樣性并鑒定其親緣關(guān)系等問題[10]，他們根據(jù)銀杏大小孢子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尋找與銀杏性別相關(guān)的位點(diǎn)，為早期銀杏性別的鑒定提供了理論依據(jù)[11]，而有關(guān)SSR 位點(diǎn)的分布、不同基元類型的組成及其特征的詳細(xì)分析等方面的研究報(bào)道卻較少。

分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定之中[12]。簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）又稱作微衛(wèi)星標(biāo)記，是一種由1～6 個(gè)堿基串聯(lián)、重復(fù)不同次數(shù)才組成的重復(fù)DNA 序列。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、標(biāo)記數(shù)量多、成本低廉、等位基因變異多等優(yōu)點(diǎn)[11，13]。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來開發(fā)SSR 引物的方法，目前常被應(yīng)用于黨參[14]、三角梅[15]、百合[16]、苧麻[17]、褐沙蒿[18]等木本植物，穿心蓮[19]、瓠瓜[20]等草本植物和冬蟲夏草[21]等真菌的研究之中，還被運(yùn)用于云南松[22]、紅松[23]、水杉[24]、穗花杉[25]等裸子植物的研究之中。當(dāng)前高通量測序手段發(fā)展迅速，測序的成本也在顯著降低，這為日后SSR 分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)提供了更大的可能性。通過對測序后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分布及特征分析，可以為以后設(shè)計(jì)、篩選SSR 引物提供更加可靠的理論依據(jù)[26-28]。

為給后續(xù)銀杏遺傳多樣性的深入分析、遺傳圖譜的構(gòu)建及其品種的鑒定奠定理論基礎(chǔ)，本研究利用Illumina HiSeq 2500 高通量測序技術(shù)進(jìn)行了銀杏葉片的轉(zhuǎn)錄組測序，建立了銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫；并使用Excel 軟件對組裝拼接后的銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了SSR 位點(diǎn)的篩選，隨之進(jìn)行后續(xù)的分布及特性分析，以期為日后銀杏SSR 分子標(biāo)記的篩選和開發(fā)、SSR 遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定及其種質(zhì)資源保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試的葉片材料一部分取自江蘇省南京市南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏樹；另一部分為2018年采自6 個(gè)品種（單株）的銀杏葉片，6 個(gè)品種（單株）分別為‘洞庭皇’、鐵馬1 號(hào)、桂林6 號(hào)、浙江長興3 號(hào)、圓鈴13 號(hào)、銀杏久壽。分別取其嫩葉，立即放入冰盒內(nèi)保存，然后置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存以備后續(xù)試驗(yàn)之用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將采集的南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏嫩葉送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 SSR 位點(diǎn)搜索

參照Grabherr[29]采用的方法，使用Trinity 軟件對南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏葉片測序所得到的銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo 組裝，再使用MISA軟件對獲得的Unigenes 序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)的搜索，對每種核苷酸重復(fù)基元的搜索次數(shù)最少為5 次，由于單核苷酸重復(fù)基元的SSR 位點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中使用較少，故未對其進(jìn)行篩選。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 軟件對銀杏葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（即SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率、平均距離、基元類型和組成及重復(fù)單元的類型）進(jìn)行分析，用這些數(shù)據(jù)反映出的特征來分析SSR 位點(diǎn)的分布特征和序列特征。其中，SSR 位點(diǎn)的平均距離是搜索所得微衛(wèi)星的長度與總長度之比，SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率是搜索到的微衛(wèi)星的數(shù)量與序列總數(shù)的比值，G+C為堿基鳥嘌呤和胞嘧啶的合稱。

1.5 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

利用Primer 3.0 軟件對銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，針對不同基元類型各設(shè)計(jì)20 對引物，利用6 個(gè)品種（單株）的銀杏葉片對所有引物進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率與平均距離

SSR 位點(diǎn)的搜索結(jié)果見表1。通過對銀杏轉(zhuǎn)錄組的組裝，總共獲得了去冗長的Unigenes 序列299 373 條，其總長度為232 983 457 bp，即232 983.457 kb；其中，G+C 的占比為42.82%。由表1可知，共搜索到17 821 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其總長為278.542 kb，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率為5.95%，其中，有16 163 條Unigenes 序列含有1 個(gè)以上的SSR 位點(diǎn)，還有1 695 條Unigenes 序列含有以復(fù)合物形式存在的SSR 位點(diǎn)。由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可知，平均長為13 073.53 bp 的序列中就有1 個(gè)SSR 位點(diǎn)，即每13.07 kb 長的序列中就有1 個(gè)SSR 位點(diǎn)。

表1 銀杏轉(zhuǎn)錄組各SSR 位點(diǎn)的分布特征Table 1 The distribution characteristics of various SSR in G.biloba

2.2 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 的基元類型

銀杏轉(zhuǎn)錄組中擁有豐富的SSR 基元類型。對各SSR 重復(fù)基元進(jìn)行檢索，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知，基元類型為二核苷酸的重復(fù)次數(shù)最多，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的74.46%；其次是三核苷酸，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的23.37%；其他類型的基元類型，如四核苷酸、六核苷酸和五核苷酸的占比均較低，分別為1.32%、0.53%和0.31%。從SSR 各基元類型的分布距離來看，五核苷酸的平均分布距離最長，為4 160.42 kb，即平均每隔4 160.42 kb 就可識(shí)別到一個(gè)五核苷酸的SSR 位點(diǎn)；其次是六核苷酸，其平均分布距離為2 452.46 kb，即平均每隔2 452.46 kb 就可識(shí)別到一個(gè)六核苷酸的SSR 位點(diǎn)；而分布距離最短的是二核苷酸，其平均分布距離為17.56 kb，即平均每隔17.56 kb 就可識(shí)別到一個(gè)二核苷酸的SSR 位點(diǎn)，其次分別是四核苷酸和三核苷酸，其平均分布距離分別為991.42 和55.94 bp。通過統(tǒng)計(jì)其出現(xiàn)頻率可知，出現(xiàn)頻率最高的是基元類型為二核苷酸的基元，其占比為4.43%；出現(xiàn)頻率最低的是基元類型為五核苷酸的基元，其占比為0.02%。

表2 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 位點(diǎn)不同基元類型的檢索結(jié)果Table 2 Transcriptome-based search results for different motif types of G.biloba SSR sites

2.3 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)單元堿基的組成與比例

銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)單元堿基的組成種類多樣，其比例也不同，檢測結(jié)果見表3。由表3可知，在銀杏葉片轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)中，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元種類數(shù)分別為4、10、13、16、24 種，其中，二核苷酸的主要重復(fù)基元是AG，共有5 559 個(gè)，其占二核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%；三核苷酸的主要重復(fù)基元是AAG，共有828 個(gè)，其占三核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的4.65%；四核苷酸的主要重復(fù)基元是AAGT，共有41 個(gè)，其占四核苷酸SSR位點(diǎn)總數(shù)的0.23%；五核苷酸的主要重復(fù)基元有兩種，分別是AAAAT 和AAATT，各有7 個(gè)，共占五核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.04%；六核苷酸的主要重復(fù)基元是AACCCG，共有19 個(gè)，其占六核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.11%。

表3 銀杏轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)重復(fù)的基元序列特征Table 3 Characteristics of SSR site repeat motifs sequence in transcriptome of G.biloba

基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序類型的分布情況見表4，銀杏轉(zhuǎn)錄組中不同SSR 基序類型的比例如圖1所示。分析不同基元類型的組成比例時(shí)發(fā)現(xiàn)，在二核苷酸的重復(fù)基元中，出現(xiàn)次數(shù)最多的是AG/CT，一共有5 559 個(gè)，占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的41.89%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%；其次是AT/TA，一共有4 785 個(gè)，占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的36.06%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的26.85%；而出現(xiàn)次數(shù)最少的是CG/GC，僅有197 個(gè)，占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的1.48%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的1.11%。在三核苷酸的重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最高的是AAG/TTC，一共有828 個(gè)，占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的19.88%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的4.65%；其次是AAT/TAA，一共有633 個(gè)，占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的15.20%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的3.55%；出現(xiàn)次數(shù)最少的重復(fù)基元是ATC/ATG，一共有193 個(gè)，占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的4.63%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的1.08%。在四核苷酸的重復(fù)基元中，出現(xiàn)次數(shù)最多的是AAGT/ACTT，一共有41 個(gè)，占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的17.45%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.23%；出現(xiàn)次數(shù)最少的是AACC/GGTT，只有5 個(gè)，占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的2.13%，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.03%。在五核苷酸的重復(fù)基元中，出現(xiàn)次數(shù)最多的分別為AAAAT/ATTTT 和AAATT/AATTT，各有7 個(gè)，占五核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的12.50%，僅占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.04%。六核苷酸的主要重復(fù)基序是AACCCG/CGGGTT，一共有19 個(gè)，占六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的20.00%，僅占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.11%。

圖1 銀杏轉(zhuǎn)錄組中不同SSR 基序類型的占比Fig.1 Ratio of different SSR motif types in G.biloba transcriptome

表4 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序類型的分布情況Table 4 Distribution of SSR motif types in G.biloba based on transcriptome

2.4 銀杏轉(zhuǎn)錄組中各個(gè)基元的重復(fù)次數(shù)

對銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中5 種基元類型的SSR 位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行了檢索統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表5。由表5可知，不同基元類型SSR 位點(diǎn)的重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)集中為5～11 次；重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)為5～11 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)共計(jì)16 076 個(gè)，占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的90.21%。其中，重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)為5 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)共計(jì)9 367 個(gè)，占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的比例（52.56%）最大；其次依次是重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)分別為6 和7 次的，其SSR 位點(diǎn)數(shù)分別占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的15.73%（2 804 個(gè)）和7.59%（1 352 個(gè)）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)出現(xiàn)5 次的 SSR 位點(diǎn)數(shù)中，二核苷酸最多（6 505 個(gè)），其次是三核苷酸（2 623 個(gè)）。SSR 位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)在11 次以上的不同基元類型的SSR 位點(diǎn)總數(shù)占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的9.79%。不同基元類型不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)的分布情況如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的增加，不同基元類型的SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率會(huì)隨之降低。

圖2 不同基元類型不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)Table 2 The number of SSR loci with different repeat times and different primitive types

表5 不同基元類型的不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)Table 5 The number of SSR sites of different repetition types in different repetition times

2.5 銀杏轉(zhuǎn)錄組中基序的長度分布

銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基序長度的分布情況如圖3所示。由圖3可知，銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)長度大部分集中為10～20 bp，此類SSR 位點(diǎn)共有14 822 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的83.17%；其次是基序長度為21～30 bp 的SSR 位點(diǎn)，共有2 039 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)中的11.44%；而基序長度分別為31～40、41～50、51～60、60 bp 以上的SSR位點(diǎn)數(shù)分別為622、199、69、10 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的比例分別為3.49%、1.12%、0.39%、0.06%。所有SSR 位點(diǎn)的平均長度是15.63 bp，其中，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的平均長度分別為14.89、16.94、22.71、32.86、34.11 bp，并且隨著基序長度的增加，SSR位點(diǎn)的數(shù)量總體趨勢是減少的，但六核苷酸的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)略多于五核苷酸的。

圖3 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序長度的分布情況Fig.3 Repetitive length distribution map of G.biloba SSR based on transcriptome

2.6 引物篩選及PCR 產(chǎn)物檢測

試驗(yàn)所用的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 反應(yīng)所需的2×Taq PCR Master Mix 和DNA marker 均購買于擎科生物（南京）有限公司。使用不同品種（單株）的6 份銀杏葉片樣品的DNA 模板對100 對引物進(jìn)行篩選，結(jié)果篩選出了條帶清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性均好的引物，然后對其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，部分結(jié)果如圖4所示，對應(yīng)的引物信息見表6。

表6 不同銀杏葉片樣品不同SSR 引物的部分序列信息Table 6 Partial sequence information of SSR primers

圖4 6 個(gè)品種（單株）銀杏葉片樣品的SSR 引物PCR 擴(kuò)增的部分結(jié)果Fig.4 Partial results of PCR amplification with SSR primers

3 結(jié)論與討論

通過對銀杏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的組裝及搜索，總共獲得了299 373 條去冗長的Unigenes 序列，其總長度為232 983.457 kb，搜索到的SSR 位點(diǎn)共有17 821 個(gè)，其總長為278.542 kb，其出現(xiàn)頻率為5.95%，平均分布距離為13.07 kb，其中G+C的比例為42.82%。該結(jié)果高于裸子植物中云南松的SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率（3.07%），其平均分布距離比云南松的平均分布距離（29 kb）短[22]，同時(shí)高于紅松SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率（4.24%）、短于紅松SSR 位點(diǎn)的平均分布距離（17.38 kb）[21]，略低于楊樹SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率（14.8%）[30]。由此可知，銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率相對較高且其平均分布距離較短，這一結(jié)果說明了銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與種類均較多。

目前，大多數(shù)研究者對植物轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)SSR 位點(diǎn)的分析結(jié)果都顯示，SSR 位點(diǎn)中以二核苷酸與三核苷酸為主，不同的只是主導(dǎo)的重復(fù)基元不一樣，這與蔡年輝等[22]對云南松的研究結(jié)果類似。分析銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可知，銀杏轉(zhuǎn)錄組中擁有豐富的SSR 基元類型：其中，二核苷酸的基元類型重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)最多，共有13 270 個(gè)，占搜素到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的74.46%；其次是三核苷酸，占搜素到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的23.37%；其他類型的基元類型四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的占比均較低，分別為1.32%、0.31%和0.53%。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的平均分布距離分別為17.56、55.94、991.42、4 160.42、2 452.46 kb，其出現(xiàn)頻率分別為4.43 %、1.39%、0.08%、0.02%、0.03%。

SSR 重復(fù)單元堿基的組成種類多樣，在銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)的組成中，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元數(shù)分別為4、10、13、16、24、67 種，5 種基元類型重復(fù)次數(shù)最多的堿基組成之和占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的36.22%，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元類型分別占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%、4.65%、0.23%、0.04%、0.11%；在二核苷酸的重復(fù)基元中，主要的重復(fù)基序是AG/CT，共有5 556 個(gè)，占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的41.87%；在三核苷酸的重復(fù)基元中，主要的重復(fù)基序是AAG/TTC，共有828 個(gè)，占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的19.88%；在四核苷酸的重復(fù)基元中，主要的重復(fù)基序是AAGT/ACTT，共有41 個(gè)，占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的20.00%；在五核苷酸的重復(fù)基元中，主要的重復(fù)基序分別為AAAAT/ATTTT 和AAATT/AATTT，各有7 個(gè)，分別占五核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的12.50%；在六核苷酸的重復(fù)基元中，主要的重復(fù)基序是AACCCG/CGGGTT，共19 個(gè)，占六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的17.45%。

有關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為，重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)多的SSR位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性潛力[31]，5 種基元類型重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)集中為5～11 次的SSR 位點(diǎn)共計(jì)16 076 個(gè)，占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的90.21%，重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)在11 次以上的重復(fù)類型占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的9.79%。據(jù)此結(jié)果可以認(rèn)為，銀杏具有較高多態(tài)性的潛力。其中，占搜索到的SSR位點(diǎn)總數(shù)的比例最多的是重復(fù)出現(xiàn)5 次的SSR 位點(diǎn)，共計(jì)9 367 個(gè)，占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的52.56%；其次是重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)分別為6 和7 次的SSR 位點(diǎn)，分別占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的15.73%（2 804 個(gè)）和7.59%（1 352 個(gè)）。其中，基元類型為二核苷酸的重復(fù)出現(xiàn)5 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)量最多（6 505 個(gè)）。隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR 位點(diǎn)數(shù)量的出現(xiàn)頻率整體呈降低趨勢。

由于不同基元的不同重復(fù)次數(shù)及堿基數(shù)量不同而形成了長度不同的序列，對SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性產(chǎn)生了影響[32]。因此，影響其多態(tài)性的因素主要是SSR 位點(diǎn)的長度[33-34]。銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)總數(shù)中有將近95%的位點(diǎn)其基序長度集中為10～30 bp；其中，基序長度為10～20 bp的SSR 位點(diǎn)有14 822 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的83.17%；基序長度為21～30 bp 的SSR 位點(diǎn)共有2 039 個(gè)，占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的11.44%；基序長度分別為31～40、41～50、51～60 及60 bp 以上的SSR 位點(diǎn)數(shù)量均較少，分別有622、199、69 和10個(gè)，分別占SSR位點(diǎn)總數(shù)的3.49%、1.12%、0.39%和0.06%。根據(jù)基序長度在一定長度范圍內(nèi)傾向于擴(kuò)張的理論可知，銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)基序長度大多數(shù)傾向于擴(kuò)張，所以測序所得的銀杏轉(zhuǎn)錄組中的SSR 位點(diǎn)大部分具有多態(tài)性的潛力且突變出現(xiàn)的頻率較低，能夠用于后續(xù)的具有較強(qiáng)多態(tài)性的銀杏SSR 引物的設(shè)計(jì)和開發(fā)之中[13，35]。

總體來看，銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率較高，分布距離近，SSR 位點(diǎn)的重復(fù)類型及其重復(fù)基元均較豐富?；谝陨咸攸c(diǎn)開發(fā)的引物具有多態(tài)性的潛力。本試驗(yàn)對開發(fā)的SSR 引物的檢測局限于6 份不同品種（單株）的銀杏葉片樣品之間，對其SSR 位點(diǎn)的挖掘也停留在特征分析層面，而對后續(xù)SSR 引物的大量開發(fā)和廣泛應(yīng)用、銀杏品種之間的遺傳多樣性分析以及構(gòu)建遺傳圖譜則需要對更多品種進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)驗(yàn)證。