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    銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布及其序列特征分析

    2021-07-09 03:09:04范雪嬌汪貴斌楊曉明周婷婷
    經(jīng)濟(jì)林研究 2021年2期
    關(guān)鍵詞:基序基元核苷酸

    范雪嬌,汪貴斌,楊曉明,周婷婷,任 重

    (南京林業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210037)

    銀杏Ginkgo bilobaL.為銀杏科銀杏屬植物,起源于古生代晚期,至今已有2.7 億~3.5 億年的演化歷史,在經(jīng)歷過第四冰期后,銀杏僅在我國殘存,后被引種至其他國家,銀杏是世界著名的中生代孑遺植物,也被譽(yù)為植物界的“活化石”,其種質(zhì)資源十分珍貴[1-5]。銀杏為落葉大喬木,雌雄異株,又被稱為白果樹、公孫樹。銀杏的用途十分廣泛,目前,銀杏在食用、觀賞、生態(tài)防護(hù)、經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療保健及科學(xué)研究等方面都具有很高的應(yīng)用價(jià)值,尤其是銀杏的藥用價(jià)值已在世界范圍內(nèi)受到關(guān)注[6-8]。2015—2019年,浙江大學(xué)、中國科學(xué)院植物研究所和華大基因研究院的科學(xué)家們在構(gòu)建了銀杏首個(gè)基因組草圖后對全球545 棵銀杏大樹進(jìn)行了基因組重測序,2019年終于構(gòu)建了迄今為止最大的銀杏遺傳數(shù)據(jù)庫,這為認(rèn)識(shí)銀杏的進(jìn)化歷史與進(jìn)化潛力提供了重要信息[9]。曾有學(xué)者研究了如何利用ISSR 分子標(biāo)記來分析銀杏種質(zhì)資源的遺傳多樣性并鑒定其親緣關(guān)系等問題[10],他們根據(jù)銀杏大小孢子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尋找與銀杏性別相關(guān)的位點(diǎn),為早期銀杏性別的鑒定提供了理論依據(jù)[11],而有關(guān)SSR 位點(diǎn)的分布、不同基元類型的組成及其特征的詳細(xì)分析等方面的研究報(bào)道卻較少。

    分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定之中[12]。簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)又稱作微衛(wèi)星標(biāo)記,是一種由1~6 個(gè)堿基串聯(lián)、重復(fù)不同次數(shù)才組成的重復(fù)DNA 序列。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、標(biāo)記數(shù)量多、成本低廉、等位基因變異多等優(yōu)點(diǎn)[11,13]。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來開發(fā)SSR 引物的方法,目前常被應(yīng)用于黨參[14]、三角梅[15]、百合[16]、苧麻[17]、褐沙蒿[18]等木本植物,穿心蓮[19]、瓠瓜[20]等草本植物和冬蟲夏草[21]等真菌的研究之中,還被運(yùn)用于云南松[22]、紅松[23]、水杉[24]、穗花杉[25]等裸子植物的研究之中。當(dāng)前高通量測序手段發(fā)展迅速,測序的成本也在顯著降低,這為日后SSR 分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)提供了更大的可能性。通過對測序后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分布及特征分析,可以為以后設(shè)計(jì)、篩選SSR 引物提供更加可靠的理論依據(jù)[26-28]。

    為給后續(xù)銀杏遺傳多樣性的深入分析、遺傳圖譜的構(gòu)建及其品種的鑒定奠定理論基礎(chǔ),本研究利用Illumina HiSeq 2500 高通量測序技術(shù)進(jìn)行了銀杏葉片的轉(zhuǎn)錄組測序,建立了銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫;并使用Excel 軟件對組裝拼接后的銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了SSR 位點(diǎn)的篩選,隨之進(jìn)行后續(xù)的分布及特性分析,以期為日后銀杏SSR 分子標(biāo)記的篩選和開發(fā)、SSR 遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定及其種質(zhì)資源保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    供試的葉片材料一部分取自江蘇省南京市南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏樹;另一部分為2018年采自6 個(gè)品種(單株)的銀杏葉片,6 個(gè)品種(單株)分別為‘洞庭皇’、鐵馬1 號(hào)、桂林6 號(hào)、浙江長興3 號(hào)、圓鈴13 號(hào)、銀杏久壽。分別取其嫩葉,立即放入冰盒內(nèi)保存,然后置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存以備后續(xù)試驗(yàn)之用。

    1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

    將采集的南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏嫩葉送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

    1.3 SSR 位點(diǎn)搜索

    參照Grabherr[29]采用的方法,使用Trinity 軟件對南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的銀杏葉片測序所得到的銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo 組裝,再使用MISA軟件對獲得的Unigenes 序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)的搜索,對每種核苷酸重復(fù)基元的搜索次數(shù)最少為5 次,由于單核苷酸重復(fù)基元的SSR 位點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中使用較少,故未對其進(jìn)行篩選。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    利用Excel 軟件對銀杏葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(即SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率、平均距離、基元類型和組成及重復(fù)單元的類型)進(jìn)行分析,用這些數(shù)據(jù)反映出的特征來分析SSR 位點(diǎn)的分布特征和序列特征。其中,SSR 位點(diǎn)的平均距離是搜索所得微衛(wèi)星的長度與總長度之比,SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率是搜索到的微衛(wèi)星的數(shù)量與序列總數(shù)的比值,G+C為堿基鳥嘌呤和胞嘧啶的合稱。

    1.5 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

    利用Primer 3.0 軟件對銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),針對不同基元類型各設(shè)計(jì)20 對引物,利用6 個(gè)品種(單株)的銀杏葉片對所有引物進(jìn)行篩選。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率與平均距離

    SSR 位點(diǎn)的搜索結(jié)果見表1。通過對銀杏轉(zhuǎn)錄組的組裝,總共獲得了去冗長的Unigenes 序列299 373 條,其總長度為232 983 457 bp,即232 983.457 kb;其中,G+C 的占比為42.82%。由表1可知,共搜索到17 821 個(gè)SSR 位點(diǎn),其總長為278.542 kb,SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率為5.95%,其中,有16 163 條Unigenes 序列含有1 個(gè)以上的SSR 位點(diǎn),還有1 695 條Unigenes 序列含有以復(fù)合物形式存在的SSR 位點(diǎn)。由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可知,平均長為13 073.53 bp 的序列中就有1 個(gè)SSR 位點(diǎn),即每13.07 kb 長的序列中就有1 個(gè)SSR 位點(diǎn)。

    表1 銀杏轉(zhuǎn)錄組各SSR 位點(diǎn)的分布特征Table 1 The distribution characteristics of various SSR in G.biloba

    2.2 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 的基元類型

    銀杏轉(zhuǎn)錄組中擁有豐富的SSR 基元類型。對各SSR 重復(fù)基元進(jìn)行檢索,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知,基元類型為二核苷酸的重復(fù)次數(shù)最多,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的74.46%;其次是三核苷酸,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的23.37%;其他類型的基元類型,如四核苷酸、六核苷酸和五核苷酸的占比均較低,分別為1.32%、0.53%和0.31%。從SSR 各基元類型的分布距離來看,五核苷酸的平均分布距離最長,為4 160.42 kb,即平均每隔4 160.42 kb 就可識(shí)別到一個(gè)五核苷酸的SSR 位點(diǎn);其次是六核苷酸,其平均分布距離為2 452.46 kb,即平均每隔2 452.46 kb 就可識(shí)別到一個(gè)六核苷酸的SSR 位點(diǎn);而分布距離最短的是二核苷酸,其平均分布距離為17.56 kb,即平均每隔17.56 kb 就可識(shí)別到一個(gè)二核苷酸的SSR 位點(diǎn),其次分別是四核苷酸和三核苷酸,其平均分布距離分別為991.42 和55.94 bp。通過統(tǒng)計(jì)其出現(xiàn)頻率可知,出現(xiàn)頻率最高的是基元類型為二核苷酸的基元,其占比為4.43%;出現(xiàn)頻率最低的是基元類型為五核苷酸的基元,其占比為0.02%。

    表2 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 位點(diǎn)不同基元類型的檢索結(jié)果Table 2 Transcriptome-based search results for different motif types of G.biloba SSR sites

    2.3 銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)單元堿基的組成與比例

    銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)單元堿基的組成種類多樣,其比例也不同,檢測結(jié)果見表3。由表3可知,在銀杏葉片轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)中,二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元種類數(shù)分別為4、10、13、16、24 種,其中,二核苷酸的主要重復(fù)基元是AG,共有5 559 個(gè),其占二核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%;三核苷酸的主要重復(fù)基元是AAG,共有828 個(gè),其占三核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的4.65%;四核苷酸的主要重復(fù)基元是AAGT,共有41 個(gè),其占四核苷酸SSR位點(diǎn)總數(shù)的0.23%;五核苷酸的主要重復(fù)基元有兩種,分別是AAAAT 和AAATT,各有7 個(gè),共占五核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.04%;六核苷酸的主要重復(fù)基元是AACCCG,共有19 個(gè),其占六核苷酸SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.11%。

    表3 銀杏轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)重復(fù)的基元序列特征Table 3 Characteristics of SSR site repeat motifs sequence in transcriptome of G.biloba

    基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序類型的分布情況見表4,銀杏轉(zhuǎn)錄組中不同SSR 基序類型的比例如圖1所示。分析不同基元類型的組成比例時(shí)發(fā)現(xiàn),在二核苷酸的重復(fù)基元中,出現(xiàn)次數(shù)最多的是AG/CT,一共有5 559 個(gè),占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的41.89%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%;其次是AT/TA,一共有4 785 個(gè),占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的36.06%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的26.85%;而出現(xiàn)次數(shù)最少的是CG/GC,僅有197 個(gè),占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的1.48%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的1.11%。在三核苷酸的重復(fù)基元中,出現(xiàn)頻率最高的是AAG/TTC,一共有828 個(gè),占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的19.88%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的4.65%;其次是AAT/TAA,一共有633 個(gè),占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的15.20%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的3.55%;出現(xiàn)次數(shù)最少的重復(fù)基元是ATC/ATG,一共有193 個(gè),占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的4.63%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的1.08%。在四核苷酸的重復(fù)基元中,出現(xiàn)次數(shù)最多的是AAGT/ACTT,一共有41 個(gè),占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的17.45%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.23%;出現(xiàn)次數(shù)最少的是AACC/GGTT,只有5 個(gè),占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的2.13%,占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.03%。在五核苷酸的重復(fù)基元中,出現(xiàn)次數(shù)最多的分別為AAAAT/ATTTT 和AAATT/AATTT,各有7 個(gè),占五核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的12.50%,僅占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.04%。六核苷酸的主要重復(fù)基序是AACCCG/CGGGTT,一共有19 個(gè),占六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的20.00%,僅占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的0.11%。

    圖1 銀杏轉(zhuǎn)錄組中不同SSR 基序類型的占比Fig.1 Ratio of different SSR motif types in G.biloba transcriptome

    表4 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序類型的分布情況Table 4 Distribution of SSR motif types in G.biloba based on transcriptome

    2.4 銀杏轉(zhuǎn)錄組中各個(gè)基元的重復(fù)次數(shù)

    對銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中5 種基元類型的SSR 位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行了檢索統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表5。由表5可知,不同基元類型SSR 位點(diǎn)的重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)集中為5~11 次;重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)為5~11 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)共計(jì)16 076 個(gè),占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的90.21%。其中,重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)為5 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)共計(jì)9 367 個(gè),占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的比例(52.56%)最大;其次依次是重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)分別為6 和7 次的,其SSR 位點(diǎn)數(shù)分別占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的15.73%(2 804 個(gè))和7.59%(1 352 個(gè))。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在重復(fù)出現(xiàn)5 次的 SSR 位點(diǎn)數(shù)中,二核苷酸最多(6 505 個(gè)),其次是三核苷酸(2 623 個(gè))。SSR 位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)在11 次以上的不同基元類型的SSR 位點(diǎn)總數(shù)占檢索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的9.79%。不同基元類型不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)的分布情況如圖2所示。從圖2中可以看出,隨著重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的增加,不同基元類型的SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率會(huì)隨之降低。

    圖2 不同基元類型不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)Table 2 The number of SSR loci with different repeat times and different primitive types

    表5 不同基元類型的不同重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)Table 5 The number of SSR sites of different repetition types in different repetition times

    2.5 銀杏轉(zhuǎn)錄組中基序的長度分布

    銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基序長度的分布情況如圖3所示。由圖3可知,銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)長度大部分集中為10~20 bp,此類SSR 位點(diǎn)共有14 822 個(gè),占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的83.17%;其次是基序長度為21~30 bp 的SSR 位點(diǎn),共有2 039 個(gè),占SSR 位點(diǎn)總數(shù)中的11.44%;而基序長度分別為31~40、41~50、51~60、60 bp 以上的SSR位點(diǎn)數(shù)分別為622、199、69、10 個(gè),占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的比例分別為3.49%、1.12%、0.39%、0.06%。所有SSR 位點(diǎn)的平均長度是15.63 bp,其中,二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的平均長度分別為14.89、16.94、22.71、32.86、34.11 bp,并且隨著基序長度的增加,SSR位點(diǎn)的數(shù)量總體趨勢是減少的,但六核苷酸的SSR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)略多于五核苷酸的。

    圖3 基于轉(zhuǎn)錄組的銀杏SSR 基序長度的分布情況Fig.3 Repetitive length distribution map of G.biloba SSR based on transcriptome

    2.6 引物篩選及PCR 產(chǎn)物檢測

    試驗(yàn)所用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR 反應(yīng)所需的2×Taq PCR Master Mix 和DNA marker 均購買于擎科生物(南京)有限公司。使用不同品種(單株)的6 份銀杏葉片樣品的DNA 模板對100 對引物進(jìn)行篩選,結(jié)果篩選出了條帶清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性均好的引物,然后對其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,部分結(jié)果如圖4所示,對應(yīng)的引物信息見表6。

    表6 不同銀杏葉片樣品不同SSR 引物的部分序列信息Table 6 Partial sequence information of SSR primers

    圖4 6 個(gè)品種(單株)銀杏葉片樣品的SSR 引物PCR 擴(kuò)增的部分結(jié)果Fig.4 Partial results of PCR amplification with SSR primers

    3 結(jié)論與討論

    通過對銀杏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的組裝及搜索,總共獲得了299 373 條去冗長的Unigenes 序列,其總長度為232 983.457 kb,搜索到的SSR 位點(diǎn)共有17 821 個(gè),其總長為278.542 kb,其出現(xiàn)頻率為5.95%,平均分布距離為13.07 kb,其中G+C的比例為42.82%。該結(jié)果高于裸子植物中云南松的SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率(3.07%),其平均分布距離比云南松的平均分布距離(29 kb)短[22],同時(shí)高于紅松SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率(4.24%)、短于紅松SSR 位點(diǎn)的平均分布距離(17.38 kb)[21],略低于楊樹SSR 位點(diǎn)的總體出現(xiàn)頻率(14.8%)[30]。由此可知,銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率相對較高且其平均分布距離較短,這一結(jié)果說明了銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與種類均較多。

    目前,大多數(shù)研究者對植物轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)SSR 位點(diǎn)的分析結(jié)果都顯示,SSR 位點(diǎn)中以二核苷酸與三核苷酸為主,不同的只是主導(dǎo)的重復(fù)基元不一樣,這與蔡年輝等[22]對云南松的研究結(jié)果類似。分析銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可知,銀杏轉(zhuǎn)錄組中擁有豐富的SSR 基元類型:其中,二核苷酸的基元類型重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)最多,共有13 270 個(gè),占搜素到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的74.46%;其次是三核苷酸,占搜素到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的23.37%;其他類型的基元類型四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的占比均較低,分別為1.32%、0.31%和0.53%。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的平均分布距離分別為17.56、55.94、991.42、4 160.42、2 452.46 kb,其出現(xiàn)頻率分別為4.43 %、1.39%、0.08%、0.02%、0.03%。

    SSR 重復(fù)單元堿基的組成種類多樣,在銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)的組成中,二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元數(shù)分別為4、10、13、16、24、67 種,5 種基元類型重復(fù)次數(shù)最多的堿基組成之和占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的36.22%,二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的基元類型分別占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的31.19%、4.65%、0.23%、0.04%、0.11%;在二核苷酸的重復(fù)基元中,主要的重復(fù)基序是AG/CT,共有5 556 個(gè),占二核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的41.87%;在三核苷酸的重復(fù)基元中,主要的重復(fù)基序是AAG/TTC,共有828 個(gè),占三核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的19.88%;在四核苷酸的重復(fù)基元中,主要的重復(fù)基序是AAGT/ACTT,共有41 個(gè),占四核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的20.00%;在五核苷酸的重復(fù)基元中,主要的重復(fù)基序分別為AAAAT/ATTTT 和AAATT/AATTT,各有7 個(gè),分別占五核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的12.50%;在六核苷酸的重復(fù)基元中,主要的重復(fù)基序是AACCCG/CGGGTT,共19 個(gè),占六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)的17.45%。

    有關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為,重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)多的SSR位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性潛力[31],5 種基元類型重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)集中為5~11 次的SSR 位點(diǎn)共計(jì)16 076 個(gè),占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的90.21%,重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)在11 次以上的重復(fù)類型占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的9.79%。據(jù)此結(jié)果可以認(rèn)為,銀杏具有較高多態(tài)性的潛力。其中,占搜索到的SSR位點(diǎn)總數(shù)的比例最多的是重復(fù)出現(xiàn)5 次的SSR 位點(diǎn),共計(jì)9 367 個(gè),占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的52.56%;其次是重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)分別為6 和7 次的SSR 位點(diǎn),分別占搜索到的SSR 位點(diǎn)總數(shù)的15.73%(2 804 個(gè))和7.59%(1 352 個(gè))。其中,基元類型為二核苷酸的重復(fù)出現(xiàn)5 次的SSR 位點(diǎn)數(shù)量最多(6 505 個(gè))。隨著重復(fù)次數(shù)的增加,SSR 位點(diǎn)數(shù)量的出現(xiàn)頻率整體呈降低趨勢。

    由于不同基元的不同重復(fù)次數(shù)及堿基數(shù)量不同而形成了長度不同的序列,對SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性產(chǎn)生了影響[32]。因此,影響其多態(tài)性的因素主要是SSR 位點(diǎn)的長度[33-34]。銀杏轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)總數(shù)中有將近95%的位點(diǎn)其基序長度集中為10~30 bp;其中,基序長度為10~20 bp的SSR 位點(diǎn)有14 822 個(gè),占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的83.17%;基序長度為21~30 bp 的SSR 位點(diǎn)共有2 039 個(gè),占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的11.44%;基序長度分別為31~40、41~50、51~60 及60 bp 以上的SSR 位點(diǎn)數(shù)量均較少,分別有622、199、69 和10個(gè),分別占SSR位點(diǎn)總數(shù)的3.49%、1.12%、0.39%和0.06%。根據(jù)基序長度在一定長度范圍內(nèi)傾向于擴(kuò)張的理論可知,銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)基序長度大多數(shù)傾向于擴(kuò)張,所以測序所得的銀杏轉(zhuǎn)錄組中的SSR 位點(diǎn)大部分具有多態(tài)性的潛力且突變出現(xiàn)的頻率較低,能夠用于后續(xù)的具有較強(qiáng)多態(tài)性的銀杏SSR 引物的設(shè)計(jì)和開發(fā)之中[13,35]。

    總體來看,銀杏轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率較高,分布距離近,SSR 位點(diǎn)的重復(fù)類型及其重復(fù)基元均較豐富?;谝陨咸攸c(diǎn)開發(fā)的引物具有多態(tài)性的潛力。本試驗(yàn)對開發(fā)的SSR 引物的檢測局限于6 份不同品種(單株)的銀杏葉片樣品之間,對其SSR 位點(diǎn)的挖掘也停留在特征分析層面,而對后續(xù)SSR 引物的大量開發(fā)和廣泛應(yīng)用、銀杏品種之間的遺傳多樣性分析以及構(gòu)建遺傳圖譜則需要對更多品種進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)驗(yàn)證。

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