高乳酸血癥對(duì)膿毒癥小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響及作用機(jī)制

劉 奇，趙洪強(qiáng)，姚人騏，姚詠明，李為民

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院 肝膽胰外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心，北京 100048；4 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部 創(chuàng)傷研究中心，北京 100853

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染應(yīng)答紊亂所引起的危及生命的器官功能障礙，是重癥監(jiān)護(hù)病房患者的主要死亡原因[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)單純的抗炎治療并不能顯著改善膿毒癥患者生存及預(yù)后，而機(jī)體免疫應(yīng)答障礙甚至麻痹可能是導(dǎo)致膿毒癥患者高死亡率的主要原因[4-5]。因此，深入探討膿毒癥患者免疫功能紊亂機(jī)制對(duì)尋找有效干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能失調(diào)在膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的產(chǎn)生與持續(xù)中起到關(guān)鍵作用[6-8]。樹(shù)突狀細(xì)胞是機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[9]。嚴(yán)重膿毒癥時(shí)脾組織中的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)數(shù)量持續(xù)減少；同時(shí)影響DC的功能，表現(xiàn)為抗原提呈能力和分泌細(xì)胞因子的能力顯著下降。因此，明確膿毒癥暴露下DC功能障礙原因及具體分子機(jī)制，深入挖掘基于DC功能穩(wěn)態(tài)的有效治療靶點(diǎn)可能是逆轉(zhuǎn)膿毒癥免疫抑制的重要契機(jī)。乳酸作為無(wú)氧糖酵解重要中間代謝產(chǎn)物，對(duì)多種免疫細(xì)胞包括DC具有明顯的抑制效應(yīng)[10-12]。研究提示，膿毒性休克時(shí)乳酸酸中毒是組織缺氧的主要標(biāo)志，其異常產(chǎn)生及聚集是獨(dú)立于低血壓和多器官功能衰竭的對(duì)膿毒癥患者死亡率有較高預(yù)測(cè)價(jià)值的臨床指標(biāo)[13-16]。目前，乳酸對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制研究多來(lái)自腫瘤領(lǐng)域，關(guān)于乳酸在膿毒癥中的免疫效應(yīng)鮮有報(bào)道。本研究將重點(diǎn)探討膿毒癥條件下乳酸對(duì)DC功能的影響，為深入認(rèn)識(shí)乳酸在膿毒癥下對(duì)DC的作用及干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 179只 野 生 型 無(wú) 特 定 病 原 體 級(jí)C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)：SYXK(軍)2012-0014)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲食進(jìn)水，12 h的晝夜節(jié)律，50%的環(huán)境濕度。

2 儀 器 與 試 劑 MiniMACS磁 化 細(xì) 胞 分 選 儀(Militenyi Biotec公司，德國(guó))；流式細(xì)胞分析儀(BD公司，美國(guó))；Spectra MR全功能酶標(biāo)儀(DYNEX公司，美國(guó))；漩渦混合器(Vortex-5，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó))；96微孔板混勻儀(QB-8002，廣州永程科學(xué)設(shè)備有限公司，中國(guó))；計(jì)數(shù)板以及各種規(guī)格移液器槍頭(BD公司，美國(guó))；移液器(Eppendorf公司，德國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8 DIVE，Leica公司，德國(guó))；黏附型載玻片、蓋玻片及保濕暗盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；磷酸鹽緩沖液(PBS)，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司)；胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國(guó))；小鼠臟器淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)；抗小鼠CD11c+MicroBeads(Militenyi Biotec，德國(guó))；抗小鼠CD4+T MicroBeads(Militenyi Biotec，德國(guó))；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS；Sigma公司，美國(guó))；PerCP-Cy5.5標(biāo)記抗小鼠CD80抗體(eBioscience公司，美國(guó))；APC標(biāo)記抗小鼠CD86抗體(eBioscience公司，美國(guó))；FITC標(biāo)記抗小鼠主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)抗 體(eBioscience公司，美國(guó))；4%多聚甲醛溶液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)檢測(cè)試劑盒(Mouse IL-2 ELISA kit)，小鼠IL-4檢測(cè)試劑盒(Mouse IL-4 ELISA kit)，小鼠IL-12檢測(cè)試劑盒(Mouse IL-12 ELISA kit)，小鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)檢測(cè)試劑盒(Mouse IFN-γ ELISA kit)(北京安迪華泰科技有限公司)；刀豆素A(ConA)，羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂試劑(CFSE)，250 μg/mL 洋地黃皂苷溶液(Digitonin)，0.2% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma公司，美國(guó))；2%牛血清白蛋白溶液(BSA)(Gibco公司，美國(guó))；兔抗小鼠LC3B抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))；DAPI溶液(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；香柏油(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)。

3 膿毒癥動(dòng)物模型建立 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)構(gòu)建小鼠膿毒癥模型，120只小鼠稱重、編號(hào)，隨機(jī)分為假傷組及膿毒癥組。5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(30 mg/kg)，麻醉成功后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，碘伏棉球消毒腹部皮膚，沿腹中線切開(kāi)長(zhǎng)約1 cm縱行切口，充分暴露盲腸，使用3號(hào)線于盲腸1/2處結(jié)扎(自盲腸根部到末端為總長(zhǎng)度)，使用5 mL注射器針頭于結(jié)扎段中線處自由腸系膜緣向腸系膜對(duì)側(cè)緣貫穿盲腸1次，并且擠出少許腸內(nèi)容物，防止穿孔閉合，將盲腸輕柔的歸納于腹腔中，逐層縫合腹膜和皮膚。術(shù)畢頸部皮下予0.9%氯化鈉注射液40 mL/kg抗休克治療，術(shù)后自由進(jìn)食水，保持室溫恒定。假傷組小鼠開(kāi)腹后暴露盲腸，還納盲腸并逐層縫合腹膜及皮膚。

4 脾單個(gè)核細(xì)胞的提取 分別于CLP術(shù)后12 h、24 h、48 h及72 h脫頸處死小鼠(外周血乳酸檢測(cè)：8只/組；樹(shù)突狀細(xì)胞功能評(píng)估：3只/組；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬形成：5只/組)，59只正常小鼠用于體外實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌術(shù)取出脾，置于加有膠原酶D溶液的培養(yǎng)皿中，剪碎后37℃孵育25 min，加入EDTA再孵育5 min。將脾組織用注射器活塞于400目鋼濾網(wǎng)上研磨、過(guò)濾，收集濾液，1 200 r/min離心5 min，完全棄上清。用4 mL PBS重懸細(xì)胞，并緩慢加至裝有等體積小鼠臟器淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫中3 000 r/min離心15 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，PBS離心洗滌2遍后獲得脾單個(gè)核細(xì)胞。

5 脾DC的分離、鑒定 采用MiniMACS免疫磁性分選系統(tǒng)分離、純化DC，按照每107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞加入40 μL PBS的比例重懸混勻細(xì)胞，以每107個(gè)細(xì)胞加入10 μL抗小鼠DC微磁珠(CD11c +microbeads)的比例加入微磁珠；充分混勻后4℃避光孵育10 min，加入10倍體積PBS離心洗滌1次，棄上清后用500 μL PBS重懸混勻。將MS分選柱置入MiniMACS磁性分選磁場(chǎng)中，1 mL PBS潤(rùn)洗1次，將500 μL細(xì)胞懸液加至MS分選柱中，讓陰性細(xì)胞隨液體緩慢流出，而CD11c+DC則存留于MS柱中；500 μL PBS潤(rùn)洗MS柱3次后，加入1 mL PBS并用活塞將存留在柱中的細(xì)胞洗脫，PBS離心洗滌兩次后計(jì)數(shù)得到純化的DC。

6 DC的分組與處理 每2×106個(gè)DC加入1 mL含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，獲得超過(guò)57 mL的細(xì)胞懸液。每1 mL細(xì)胞懸液加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每3孔為1組，共19組，放入水套式CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。次日9組細(xì)胞混懸液每孔分別給予0 mmol/L 、50 mmol/L、100 mmol/L乳酸刺激后放入水套式CO2培養(yǎng)箱24 h、48 h、72 h，觀察不同濃度乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng)。另將4組作為乳酸刺激組每孔，給予100 mmol/L乳酸；2組作為L(zhǎng)PS刺激組，每孔給予1 000 ng/μL LPS；2組為L(zhǎng)PS+乳酸刺激組，每孔給予LPS 1 000 ng/μL及100 mmol乳酸刺激；1組為乳酸+3-MA組，每孔給予100 mmol乳酸及1 mmol 3-MA刺激；1組為乳酸+Bafilomycin組，每孔給予100 mmol乳酸及1 mmol Bafilomycin刺激后放入水套式CO2培養(yǎng)箱48 h。上述分組分別用于觀察LPS及乳酸刺激下DC的功能變化、自噬改變以及抑制自噬活性對(duì)乳酸介導(dǎo)DC功能障礙的影響。

7 脾CD4+T細(xì)胞的分離及純化 通過(guò)MiniMACs免疫磁性分選系統(tǒng)分離CD4+T細(xì)胞，按照每107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞40 μL PBS緩沖液的比例重懸細(xì)胞，每107個(gè)細(xì)胞加入10 μL 生物素雞尾酒抗體，4℃避光孵育5 min。按照每107個(gè)細(xì)胞加入30 μL PBS緩沖液的比例再次重懸細(xì)胞后加入抗生物素微磁珠混勻(每107個(gè)細(xì)胞加入20 μL抗生物素微磁珠)，4℃避光孵育10 min。將LS柱至于MiniMACs磁場(chǎng)中，3 mL PBS緩沖液潤(rùn)洗LS柱，加入全部細(xì)胞懸液，用PBS潤(rùn)洗LS柱3次，每次1 mL，收集流出液體即為CD4+T細(xì)胞。

8 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達(dá) 收集DC細(xì)胞，PBS離心洗滌后重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度(5×106/mL)。取100 μL細(xì)胞懸液至于流式管中，分別加入抗小鼠CD80、CD86及MHC-Ⅱ抗體各2 μL，4℃避光孵育40～60 min；10倍體積PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，棄上清，300 μL PBS重懸細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達(dá)情況。

9 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度 按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明，分別檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-12、IL-4、IFN-γ和IL-2水平。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處測(cè)吸光度值。

10 混合淋巴細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)DC對(duì)T細(xì)胞增殖、分泌及分化的影響 將CD4+T細(xì)胞按照2×106/mL的細(xì)胞濃度用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸(含10%FBS)，在刀豆蛋白A(ConA)刺激下培養(yǎng)24 h后，按照DC∶T=1∶100的比例加入DC后繼續(xù)培養(yǎng)68～72 h。采用CFSE檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性；ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)上清中IL-2、IL-12、IFNγ及IL-4水平，反映T細(xì)胞分泌功能，并通過(guò)分析IFN-γ與IL-4的比值評(píng)估T細(xì)胞分化方向。

11 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬小體的形成 收集DC，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體(以熒光抗體結(jié)合自噬小體的LC3 puncta成分顯示)形成的數(shù)量以確定不同組內(nèi)DC自噬活性的變化。將收集的DC(約2×106個(gè))轉(zhuǎn)移至流式管中。配制破膜劑：0.025% Digitonin(8.117 μL溶 于991.883 μL PBS)。每個(gè)流式管中加入200～400 μL破膜劑，冰上破膜2 min。用PBS 1 mL重懸細(xì)胞，離心洗滌3次(1 500 r/min × 5 min)后予以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞1 h。配制1% BSA封閉液(0.1 g的BSA溶于10 mL雙蒸水)。用1%BSA封閉液室溫封閉1 h。PBS離心洗滌2次，加入LC3B一抗200～300 μL(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜；PBS離心洗滌2次，避光加熒光二抗300～500 μL(1∶200)，室溫避光孵育1 h。PBS離心洗滌3次，將細(xì)胞混懸液40 μL中加入DAPI 10 μL，滴加于黏附型載玻片上，蓋破片封片后于Leica SP8激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬體的形成及數(shù)目。

12 統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較選用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 膿毒癥小鼠外周血乳酸值變化規(guī)律及與DC功能變化相關(guān)性分析 正常組小鼠與假傷組小鼠的外周血乳酸值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。建模后12～48 h，膿毒癥組小鼠的外周血乳酸值較假傷組小鼠顯著增加(P＜0.05)，且在術(shù)后24 h達(dá)到最高值。建模后72 h膿毒癥組小鼠外周血乳酸值與正常組及假傷組小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 膿毒癥小鼠外周血乳酸濃度(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.1 Concentration of blood lactic acid in septic mice (aP＜0.05,bP＜0.01)

2 膿毒癥小鼠DC表面分子表達(dá)及刺激T細(xì)胞炎性因子分泌情況分析 進(jìn)一步分析小鼠脾DC功能發(fā)現(xiàn)，與假傷組比較，膿毒癥24 h組小鼠脾DC出現(xiàn)明顯活化，表現(xiàn)為表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，IL-12表達(dá)及與T細(xì)胞共培養(yǎng)后刺激T細(xì)胞IL-2、IFN-γ及IL-4釋放的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示膿毒癥暴露24 h小鼠處在代償階段。觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥48 h小鼠脾DC功能出現(xiàn)明顯抑制，其表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)明顯低于假傷組小鼠(P＜0.05)。同時(shí)，DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，刺激T細(xì)胞IFN-γ的分泌顯著下調(diào)(P＜0.05)，而IL-4并未降低甚至出現(xiàn)升高趨勢(shì)，導(dǎo)致IFN-γ與IL-4的比值顯著降低，T細(xì)胞向抗炎亞型Th2極化。見(jiàn)圖2。

圖2 膿毒癥小鼠DC表面分子表達(dá)及刺激T細(xì)胞炎性因子分泌(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.2 Expression of surface molecules of DCs in septic mice and its priming activity for the cytokine secretion of T cells (aP＜0.05, bP＜0.01)

3 乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證膿毒癥中高乳酸血癥與DC功能抑制之間的關(guān)系。我們體外利用不同濃度乳酸處理DC不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)乳酸能以濃度依賴性的方式對(duì)DC功能發(fā)揮抑制效應(yīng)，特別是CD80及CD86的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，且100 mmol/L刺激48 h效果最為明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸刺激DC表面分子表達(dá)Fig.3 Expression of surface molecules of DC under lactic acid stimuli

4 LPS及乳酸刺激下DC的功能變化 分別采用乳酸、LPS及LPS聯(lián)合乳酸刺激DC后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，LPS能明顯誘導(dǎo)DC功能活化，其表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)和IL-12的釋放均顯著增加(P＜0.05)，與T細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)T細(xì)胞IL-2和IFN-γ產(chǎn)生增加(P＜0.05)，并誘導(dǎo)T細(xì)胞向促炎表型Th1極化。然而，乳酸刺激組及LPS聯(lián)合乳酸刺激組DC與假傷組及LPS組比較，功能出現(xiàn)明顯抑制，出現(xiàn)表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)和IL12的釋放顯著降低(P＜0.05)，但兩組間無(wú)明顯差異。我們進(jìn)一步分析DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和LPS組比較，乳酸刺激組DC刺激T細(xì)胞能力顯著下降，IL-2及IFN-γ的分泌水平顯著降低(P＜0.05)，T細(xì)胞呈現(xiàn)向Th2極化的現(xiàn)象，而LPS加乳酸刺激組DC對(duì)T細(xì)胞的抑制效應(yīng)弱于單純?nèi)樗岽碳そMDC。見(jiàn)圖4。

圖4 LPS及乳酸刺激下DC的功能變化(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.4 Functional changes of DCs in response to stimuli by LPS and lactic acid (aP＜0.05, bP＜0.01)

5 外源性乳酸刺激DC自噬過(guò)度活化 進(jìn)一步對(duì)膿毒癥暴露下及乳酸和LPS刺激下的DC自噬活性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與假傷組比較，膿毒癥24 h及48 h DC自噬活性均明顯增強(qiáng)。DC在乳酸及LPS聯(lián)合乳酸刺激下自噬活性較對(duì)照組及LPS組明顯升高，提示自噬的過(guò)度活化可能是乳酸介導(dǎo)膿毒癥時(shí)DC功能障礙的重要原因。見(jiàn)圖5。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察DC自噬體形成及數(shù)目Fig.5 Formation and number of autophagosomes in DC were observed by laser confocal microscope

6 抑制自噬活性對(duì)乳酸介導(dǎo)DC功能障礙的影響 采用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與乳酸組比較，乳酸加3-MA組DC表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ稍增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，乳酸加3-MA組DC刺激T細(xì)胞IL-2及IFN-γ的分泌明顯高于乳酸組DC。見(jiàn)圖6。

圖6 3-MA改善乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng)(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.6 Inhibited function of DC by lactic acid was reversed by 3-MA (aP＜0.05, bP＜0.01)

7 Bafilomycin改善乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng) 予以Bafilomycin干預(yù)后，與乳酸組比較，乳酸加Bafilomycin組DC表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ稍增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生顯著增加，而IL-2及IL-4的表達(dá)無(wú)明顯差異，乳酸刺激下DC刺激T向Th2極化現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，提示多靶點(diǎn)抑制自噬活性能逆轉(zhuǎn)膿毒癥時(shí)乳酸對(duì)DC的功能抑制效應(yīng)。見(jiàn)圖7。

圖7 Bafilomycin改善乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng)(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.7 Inhibited function of DC by lactic acid was reversed by Bafilomycin (aP＜0.05, bP＜0.01)

討 論

膿毒癥是感染、燒/創(chuàng)傷、休克等急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥。隨著膿毒癥基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究的蓬勃發(fā)展，初步明確機(jī)體免疫應(yīng)答紊亂在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，維持免疫穩(wěn)態(tài)，對(duì)膿毒癥患者生存及預(yù)后具有重要意義。樹(shù)突狀細(xì)胞作為機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，其數(shù)量及功能的改變是機(jī)體免疫障礙發(fā)生的重要機(jī)制。膿毒癥時(shí)DC的抗原提呈能力和分泌細(xì)胞因子的能力受到顯著影響，導(dǎo)致其不能有效吞噬侵入機(jī)體的病原體，且難以將病原體抗原提呈給T淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致免疫麻痹，增加機(jī)體二次感染的風(fēng)險(xiǎn)。乳酸是組織灌注障礙和氧供不足早期敏感指標(biāo)，與常規(guī)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)比較，乳酸水平增高對(duì)組織低灌注與缺氧具有較高的敏感度。研究發(fā)現(xiàn)乳酸可作為評(píng)價(jià)膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)之一，具有重要的臨床意義。然而，一直以來(lái)其在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用及意義并不清楚。因此，探討膿毒癥下高乳酸血癥對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的影響及機(jī)制，不僅有助于我們理解高乳酸血癥下患者機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能變化，從而為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，而且能為膿毒癥免疫障礙的發(fā)生機(jī)制提供新的研究及防治靶點(diǎn)，具有重要理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠模型中外周血乳酸濃度顯著增加，且在24 h及48 h最為顯著。與此同時(shí)，DC表面分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表達(dá)及刺激T細(xì)胞分泌在膿毒癥術(shù)后48 h明顯抑制，并誘導(dǎo)T細(xì)胞向抗炎表型Th2極化，表明乳酸的持續(xù)暴露可能是膿毒癥時(shí)DC功能障礙的原因之一。我們進(jìn)一步通過(guò)體外培養(yǎng)的方法予以乳酸刺激DC，初步掌握乳酸誘導(dǎo)DC功能障礙的最佳濃度與時(shí)間，明確乳酸刺激體外培養(yǎng)DC能顯著抑制其功能活化及對(duì)適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)效應(yīng)。業(yè)已明確，LPS作為革蘭陰性桿菌的主要致病因素，是腹腔感染致膿毒癥的主要致病因素。基于膿毒癥動(dòng)物模型及相關(guān)致病因素分析，我們進(jìn)一步探討LPS及乳酸單獨(dú)和聯(lián)合刺激對(duì)DC免疫功能的影響。我們發(fā)現(xiàn)即使在膿毒癥早期LPS能顯著刺激DC成熟及活化的條件下，乳酸刺激相同時(shí)間能顯著抑制DC功能活化，并誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌功能減弱及向Th2極化。LPS聯(lián)合乳酸刺激DC表現(xiàn)出與乳酸刺激相同的趨勢(shì)，但兩者并無(wú)差異，表明乳酸可能是引起膿毒癥時(shí)DC應(yīng)答障礙的主要機(jī)制。

自噬對(duì)維持細(xì)胞功能穩(wěn)定及生存具有重要意義。細(xì)胞自噬功能變化與膿毒癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，過(guò)低或過(guò)強(qiáng)的自噬反應(yīng)均能加劇膿毒癥多器官功能障礙及不良預(yù)后[17]。我們進(jìn)一步分析了膿毒癥及LPS和乳酸刺激下DC自噬反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)膿毒癥持續(xù)暴露下DC自噬活性明顯升高，呈現(xiàn)出過(guò)度活化的趨勢(shì)。體外培養(yǎng)DC經(jīng)乳酸及LPS和乳酸聯(lián)合刺激后自噬活性亦呈現(xiàn)過(guò)度活化，表明過(guò)度的細(xì)胞自噬可能是乳酸介導(dǎo)膿毒癥時(shí)DC功能障礙的主要細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。我們分別采用自噬抑制劑3-MA及Bafilomycin觀察發(fā)現(xiàn)，抑制自噬的激活及功能均能有效逆轉(zhuǎn)膿毒癥時(shí)乳酸對(duì)DC功能的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步明確乳酸能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過(guò)度自噬介導(dǎo)膿毒癥時(shí)DC功能障礙，聯(lián)合調(diào)控乳酸及自噬水平可能是改善膿毒癥時(shí)DC功能紊亂的有效手段。

本研究初步探討了膿毒癥時(shí)乳酸產(chǎn)生及其與DC功能障礙的關(guān)系，并以過(guò)度自噬為切入點(diǎn)，探討了乳酸介導(dǎo)DC功能障礙的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。該研究還存在一些局限性；1)對(duì)于膿毒癥時(shí)乳酸來(lái)源并未充分闡明。前期研究表明膿毒癥時(shí)機(jī)體無(wú)氧酵解活性增強(qiáng)，組織細(xì)胞缺血缺氧是乳酸產(chǎn)生的主要來(lái)源，但基于免疫微環(huán)境中具體免疫細(xì)胞是否能產(chǎn)生乳酸需要進(jìn)一步明確。2)乳酸誘導(dǎo)過(guò)度自噬的具體分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。前期研究已經(jīng)明確，GPR81是乳酸的主要效應(yīng)受體[18]，是其發(fā)揮抑炎及免疫調(diào)理效應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)。βarrestin-2是GPR81免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的基礎(chǔ)，是其發(fā)揮功能的主要依賴性分子。因此，GPR81-βarrestin-2分子通路在乳酸介導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度自噬中的具體作用是未來(lái)深入研究的潛在靶點(diǎn)。