基于網(wǎng)絡藥理學的治傷風顆粒治療感冒的作用機制探討

李 慧, 曹博雅, 任璐彤, 魏紫櫻, 李佳怡,郭媛媛, 王 葦, 曹俊嶺, 2

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院, 北京, 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院 藥學部, 北京, 100078)

感冒是一種常見的急性上呼吸道病毒性感染性疾病，患者多伴有鼻塞、流涕、咳嗽、噴嚏、頭痛、發(fā)熱等，病情多呈自限性[1]。從中醫(yī)角度講，感冒分為風寒感冒與風熱感冒，其中風寒感冒是由外感風寒之邪所致，又稱傷風感冒，秋、冬兩季高發(fā)，伴有低熱、頭痛、四肢酸痛、鼻塞流涕、咳嗽咳痰等主要癥狀[2]。治傷風顆粒以《傷寒論》中經(jīng)典名方“葛根湯”為基礎方，配伍人參并加入對乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀和馬來酸氯苯那敏等西藥成分，可用于治療傷風頭痛、感冒發(fā)燒、支氣管炎、鼻塞、神經(jīng)痛等病癥[2]。陳麗等[3]研究結果顯示，治傷風顆?？捎行Ь徑庖蛲飧幸鹧屎聿贿m患者的臨床癥狀。本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法探討治傷風顆粒治療普通風寒感冒的活性成分及作用靶點，并構建“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，探討其潛在的作用機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 研究平臺、軟件與方法

1.1 研究平臺及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php/); 藥物靶點信息數(shù)據(jù)庫(DrugBank, https://www.drugbank.ca/); 人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards, https://www.genecards.org/); 功能蛋白關聯(lián)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫(STRING, https://string-db.org/)。R軟件(https://www.r-project.org/, 版本4.0.3); Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/, 版本3.7.1); Perl軟件(https://www.perl.org/, 版本5.32.0)。

1.2 治傷風顆粒藥物靶點篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，關鍵詞為“葛根”“麻黃”“桂枝”“白芍”“大棗”“生姜”“甘草”“人參”，主要檢索治傷風顆粒中的中藥化學成分，并以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為標準對活性成分進行初步篩選。應用TCMSP數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索復方中各成分的藥物靶點信息，并將篩選出的蛋白靶點應用R軟件轉化成UniProt ID格式。

1.3 感冒相關靶點及交集靶點的篩選

以"cold"為關鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點，獲得感冒相關靶點信息。將疾病靶點與活性成分靶點進行比對，提取出兩者的共同靶點，作為治傷風顆粒治療感冒的潛在作用靶點，利用R軟件繪制兩者交集的韋恩圖。

1.4 治傷風顆粒復方調控網(wǎng)絡的構建

將治傷風顆?；钚猿煞旨敖患悬c基因導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡，即“治傷風顆?；钚猿煞?作用靶點-感冒”的可視化交互網(wǎng)絡。

1.5 治傷風顆粒治療感冒的蛋白質-蛋白質互作(PPI)網(wǎng)絡構建

將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，設定物種來源為"Homo sapiens", 設置"minimum required interaction score"為0.700, 去除游離蛋白靶點，建立PPI并得出治傷風顆粒治療感冒作用靶點頻次。

1.6 GO分析和KEGG分析

運用R軟件對治傷風顆?？垢忻白饔冒悬c進行基因本體(GO)富集分析并繪制柱狀圖; 為闡明靶點蛋白在信號通路中的作用，進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，以P<0.05、FDR<0.05為閾值篩選顯著富集的通路，并將通路與靶點導入Cytoscape軟件繪制KEGG關系網(wǎng)絡圖。

2 結 果

2.1 治傷風顆?；钚猿煞旨跋嚓P靶點篩選結果

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(以OB≥30%且DL≥0.18為標準)和Drugbank數(shù)據(jù)庫，篩選出治傷風顆粒的主要活性成分及作用靶點(見表1), 有效成分最多的是甘草; 刪除重復成分后，得到活性成分共146種，其中中藥成分142種，西藥成分4種(對乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀、馬來酸氯苯那敏)。

表1 治傷風顆粒主要活性成分及靶點信息表

2.2 疾病靶點

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選出在感冒相關度得分均值(3.04分)以上的1 418個基因作為疾病相關靶點基因。應用R軟件繪制治傷風顆?；钚猿煞职悬c基因與感冒靶點基因交集韋恩圖，共得到117個共同靶點基因，見圖1。

圖1 治傷風顆粒與感冒作用靶點交集韋恩圖

2.3 治傷風顆粒復方調控網(wǎng)絡的構建

應用Cytoscape軟件繪制治傷風顆?？垢忻暗膹头秸{控網(wǎng)絡，共得到258個節(jié)點及1 114條邊，見圖2。從活性成分角度分析，含有活性成分最多的藥物為甘草; 度值最高的成分為槲皮素(MOL000098，度值65)、山奈酚(MOL000422，度值26)、木犀草素(MOL000006，度值24)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(MOL003896，度值18)、柚皮素(MOL004328，度值17)、延胡索堿(MOL000787，度值16)、β-谷甾醇(MOL000358，度值16)和西藥成分無水咖啡因(度值15)等，說明這些成分能夠與較多的疾病靶點發(fā)生相互作用，可能是治傷風顆粒發(fā)揮抗感冒藥效的重要成分。從靶點角度分析，PTGS2、HSP90AA1、ESR1、PTGS1、NOS2、PPARG、SCN5A、ESR2、MAPK14、ADRB2等靶點度值較高，這些靶點能與較多的藥物成分發(fā)生相互作用。

圖2 治傷風顆粒的復方調控網(wǎng)絡圖

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建

基于STRING數(shù)據(jù)庫對117個交集靶基因進行分析，得到PPI網(wǎng)絡圖，該網(wǎng)絡共有117個節(jié)點，728條邊，平均度值為12.4，見圖3。排名前15位的節(jié)點分別為IL-6、AKT1、INS、VEGFA、MAPK8、STAT3、MAPK1、IL-1β、EGFR、CCL2、PTGS2、APP、MMP9、HSP90AA1、ICAM1，這些靶點之間的相互作用關系緊密，屬于關鍵靶點，可能在感冒的發(fā)生、發(fā)展及治療中具有十分重要的意義。見圖4。

圖3 治傷風顆粒PPI網(wǎng)絡圖

圖4 治傷風顆粒治療感冒作用靶點頻次分布圖

2.5 GO富集分析

應用R軟件將篩選得到的117個交集靶點進行GO富集分析，得到了生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3個方面的數(shù)據(jù)。BP涉及細胞對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對細菌源性分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、抗氧化反應(response to oxidative stress)等; CC包括膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等; MF主要涉及兒茶酚胺結合(catecholamine binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等。見圖5。

A: BP富集分析; B: CC富集分析; C: MF富集分析。

2.6 KEGG通路富集分析

將篩選得到的117個交集靶點進行KEGG通路富集分析，共篩選出P<0.05和FDR<0.05的前20位顯著富集通路，并將通路與靶點導入Cytoscape軟件繪制KEGG關系網(wǎng)絡圖，其中富集基因較多的通路為流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等，見圖6、7。

圖6 治傷風顆粒治療感冒作用KEGG通路分析圖

3 討 論

本研究經(jīng)篩選得到治傷風顆粒的活性成分146種，其中的中藥成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、柚皮素、延胡索堿、β-谷甾醇等可能是發(fā)揮抗感冒藥效的關鍵成分。該復方中含有大量黃酮類成分，度值排名前5位的中藥成分也均為黃酮類?，F(xiàn)代藥理研究[4-5]表明，黃酮類成分具有明顯的解熱抗炎、增強免疫的作用，其中木犀草素在體內外均有較強的抗炎活性[6], 可通過AKT/Nrf2、NF-κB途徑對小鼠肺損傷發(fā)揮保護作用[7]; 山奈酚能通過抑制促炎細胞因子和趨化因子而發(fā)揮抗炎作用[8]。上述結果提示治傷風顆粒發(fā)揮抗感冒的作用可能與參與機體炎癥反應和調節(jié)免疫反應相關[9]。此外，槲皮素在體內外均可發(fā)揮抗病毒作用[10]; 槲皮素-7-葡糖苷能夠通過早期抑制病毒復制而治療人鼻病毒2(HRV2)引起的普通感冒[11]; 柚皮素既能抑制氣道黏蛋白5AC的分泌以降低痰液的黏稠度，又能促進氣道纖毛的轉運功能以促進痰液的排出，還能通過促進漿液分泌以稀釋痰液，使痰液易于咳出，發(fā)揮顯著的祛痰作用[12]。

治傷風顆粒中的西藥成分主要有對乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀和馬來酸氯苯那敏。對乙酰氨基酚具有解熱、鎮(zhèn)痛等作用，為臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥[13]; 氯苯那敏是一種羥基胺類抗組胺藥，可抑制過敏反應，減少氣道分泌物，緩解咳嗽癥狀[14]; 鹽酸那可汀為支氣管解痙性鎮(zhèn)咳藥，能解除支氣管平滑肌痙攣，抑制肺牽張反射引起的咳嗽; 咖啡因在網(wǎng)絡藥理學中是度值最高的西藥成分，作為一種中樞興奮劑，咖啡因能增強解熱鎮(zhèn)痛療效并拮抗抗組胺藥所致的嗜睡作用[15]。通過PPI網(wǎng)絡得到IL-6、AKT1、INS、VEGFA、MAPK8等15個關鍵靶點，可能在抗感冒藥效產(chǎn)生過程中具有重要的作用。IL-6為最核心靶點，與45個蛋白均有相互關聯(lián)，其是一類多功能蛋白質分子，參與機體的抗感染免疫和自身免疫[16], 研究[17]表明抑制IL-6在治療多種炎性疾病中具有重要的作用。

GO分析和KEGG通路富集分析得出治傷風顆?？垢忻暗纳镞^程和代謝通路，其生物學進程從細胞功能結構、機體代謝到應激反應等。IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等均被證實與免疫、炎癥及細胞調節(jié)等功能相關，涉及IL-6、IL-1β、MAPK1、MAPK8等基因。研究[18]表明，AGE-RAGE信號傳導途徑與炎癥密切相關，可激活MAPK和NF-κB途徑，影響免疫和氧化應激反應; NF-κB信號通路是先天性和適應性免疫反應的關鍵[19-20]; Toll樣受體能夠參與機體急性上呼吸道炎性反應的病理生理過程[21], 還能夠激活胞內轉錄因子NF-κB, 引起IL-6等促炎因子的分泌，從而介導免疫[22], 在炎癥、免疫細胞調節(jié)、存活及增殖中發(fā)揮顯著的作用; MAPKs能夠參與炎癥反應過程、調節(jié)炎癥介質[23]。此外，流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、前列腺癌通路等也有較高的富集，說明該復方的活性成分作用于多種類型的代謝通路，其發(fā)揮抗感冒療效有著復雜的機制。

圖7 治傷風顆粒治療感冒作用的KEGG關系網(wǎng)絡圖

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法探討了治傷風顆粒治療感冒的有效成分及作用靶點，并構建“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡和“靶點-通路”網(wǎng)絡，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮藥效的特點。網(wǎng)絡藥理學在理論上為治傷風顆粒治療感冒的藥效物質及作用機制的探索提供了一些有利條件，但仍需進一步的實驗研究，為其深入開發(fā)及臨床合理應用提供依據(jù)。