丹參素與小鼠心臟中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+滲漏通道SEC61α相互調(diào)節(jié)心肌梗死后纖維化的作用

劉俊雄 王毅

心肌梗死是目前較為常見且預(yù)后較差、病情危險(xiǎn)的一種疾病[1]。若治療不及時(shí)，很容易造成嚴(yán)重后果，且每年因此造成的死亡或殘疾人數(shù)，不僅給家庭和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)，也嚴(yán)重影響著患者的身心健康和生活質(zhì)量[2]。心肌梗死后的心肌纖維化屬于機(jī)體心力衰竭、心臟肥大的一種病理學(xué)特征，主要表現(xiàn)為機(jī)體心臟大量膠原蛋白、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的沉積及纖維細(xì)胞的大量增殖[3]。目前，臨床上對(duì)于心肌梗死治療的效果較為顯著，在一定程度上降低了患者的病死率，但未達(dá)到抑制其心肌纖維發(fā)展的目的，最終導(dǎo)致機(jī)體因心肌衰竭而出現(xiàn)心律失常、猝死等并發(fā)癥。同時(shí)，心肌梗死產(chǎn)生的心肌纖維化屬于較為持久，且難以逆轉(zhuǎn)的病理現(xiàn)象，因此引發(fā)的心機(jī)重構(gòu)是機(jī)體內(nèi)多種慢性疾病發(fā)生的重要病理學(xué)特征，可通過影響器官正常的生理結(jié)構(gòu)，造成器官正常功能異常，嚴(yán)重時(shí)可致使疾病惡化現(xiàn)象加劇[4]。本文主要通過研究丹參素對(duì)心肌梗死小鼠心肌纖維化的影響和作用機(jī)制，進(jìn)而增加心肌梗死纖維化的有效治療的可能性，為臨床提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6小鼠[合格證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041]，雄性，體重(20±2)g，購(gòu)自武漢大學(xué)下屬機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每天定點(diǎn)給予12 h光照時(shí)間，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在(22±3)℃，濕度為55%左右，所有小鼠在實(shí)驗(yàn)期間可自由飲食。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組:隨機(jī)將72只C57BL/6小鼠分成4組，每組18只，分別為假手術(shù)組、模型組、卡托普利組和丹參素組。

1.2.2 小鼠心肌梗死模型的建立:取模型組和藥物處理組小鼠，使用40 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射將其麻醉后，通過氣管插管后給予呼吸器，并使用室內(nèi)空氣進(jìn)行輔助通氣，其中通氣參數(shù)設(shè)置為：呼吸頻率68 cylces/min，潮氣量8 ml/100 g。使用75%乙醇消毒后，從小鼠第四肋骨位置處進(jìn)行胸廓切手術(shù)。利用錐形針，將1-0的絲線通過小鼠左冠狀動(dòng)脈開端穿入，使用絲線扎緊形成冠狀動(dòng)脈閉塞。假手術(shù)組處理方式與上述方式相同，但不結(jié)扎。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法:造模成功后，假手術(shù)組和模型組給予160 mg·kg-1·d-1的0.9%氯化鈉溶液作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，卡托普利組和丹參素組給予等量的丹參素進(jìn)行灌胃，給藥時(shí)間為7周。

1.2.4 小鼠心臟超聲評(píng)價(jià):灌胃第7周后，使用40 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射將其麻醉后，使用超聲系統(tǒng)測(cè)量小鼠左心室的收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和舒張期末期內(nèi)徑(LVEDd)及縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。

1.2.5 心重指數(shù)測(cè)定:末次給藥后，進(jìn)行小鼠全身稱重并記錄；隨后取小鼠心臟，在相對(duì)穩(wěn)定的空間內(nèi)稱重并記錄，根據(jù)全心重/體重值得到心重指數(shù)(CWI)(mg/g)。

1.2.6 羥脯氨酸含量測(cè)定:取小鼠心臟，利用羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)小鼠心臟內(nèi)羥脯氨酸含量。

1.2.7 SOD與MDA水平檢測(cè):取小鼠心肌組織，加入0.9%氯化鈉溶液于低溫條件下制成5%勻漿，并以3 000 r/min離心5 min，取上清液保存待用。按照SOD活力測(cè)定試劑盒和硫代巴比妥酸法檢測(cè)小鼠心肌組織SOD和MDA含量。

1.2.8 組織切片染色:小鼠心臟超聲檢測(cè)后，將心臟標(biāo)本按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色處理。

1.2.9 Western blot檢測(cè):取小鼠左心室的心肌組織，使用組織蛋白裂解液將其裂解后獲得總蛋白，并使用BSA測(cè)定蛋白濃度。取35 μg的總蛋白通過SDS-Page電泳實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，隨后按照SEC61一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜，顯影的方法，最后將其置于化學(xué)發(fā)光成像儀上進(jìn)行呈像。結(jié)果利用Image J進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 丹參素對(duì)小鼠心功能指標(biāo)的影響 模型組小鼠LVESd、LVEDd水平均高于假手術(shù)組，其LVEF和LVFS水平均低于假手術(shù)組(P<0.05)。同時(shí)丹參素組小鼠LVESd、LVEDd水平低于模型組，LVEF和LVFS水平均高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 心臟超聲檢測(cè)4組小鼠的心臟指標(biāo)

2.2 丹參素對(duì)小鼠心重指數(shù)的影響 模型組CWI高于假手術(shù)組、卡托普利組和丹參素組小鼠(P均<0.05)，說明丹參素可降低心肌梗死小鼠CWI。見表2。

表2 小鼠心重指數(shù)變化

2.3 丹參素對(duì)小鼠心臟羥脯氨酸含量的影響 模型組小鼠心肌組織內(nèi)羥脯氨酸含量高于假手術(shù)組和藥物處理組(P均<0.05)，由此可知，丹參素可降低心肌梗死小鼠心肌羥脯氨酸含量水平。見表3。

表3 小鼠心臟羥脯氨酸含量變化

2.4 丹參素對(duì)小鼠心臟氧化應(yīng)激水平的影響 心肌梗死模型組小鼠的SOD水平低于假手術(shù)組和藥物處理組(P<0.05)，而MDA水平均高于假手術(shù)組和藥物處理組(P<0.05)，根據(jù)SOD和MDA測(cè)定結(jié)果可知，丹參素可降低心肌梗死小鼠的SOD水平，升高小鼠MDA水平。見表4。

表4 SOD和MDA水平測(cè)定

2.5 丹參素對(duì)小鼠膠原容積分?jǐn)?shù)的影響 模型組小鼠的膠原容積分?jǐn)?shù)高于假手術(shù)組和藥物處理組(P均<0.05)，可知丹參素可降低心肌梗死小鼠膠原容積分?jǐn)?shù)。見表5。

表5 小鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.6 丹參素對(duì)小鼠心臟SEC61α蛋白表達(dá)的影響 心肌梗死模型組小鼠SEC61α蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于假手術(shù)組和藥物處理組(P均<0.05)，可知丹參素可降低心肌梗死小鼠SEC61α蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。見表6，圖1。

表6 SEC61α蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果

圖1 Western blot結(jié)果；1、2、3、4分別代表假手術(shù)組、模型組、卡托普利組和丹參素組小鼠 SEC61α蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)屬于真核細(xì)胞中用于蛋白合成的一種重要細(xì)胞器[5]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激、缺氧、異常糖基化、Ca2+失衡等情況下，機(jī)體內(nèi)存在的未折疊蛋白質(zhì)增多，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力失衡，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。SEC61屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上可用于雙向性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源性復(fù)合物[7]。在真核細(xì)胞中，SEC61主要由SEC61α、SEC61β和SEC61γ組成的3聚復(fù)合物，主要作用是在集體內(nèi)部形成疏水通道，促進(jìn)由核糖體合成的多肽由此穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部[8]。SEC61α通道蛋白在結(jié)構(gòu)上具有10次可用于跨膜的結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，SEC61α突變可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生[9]。心肌纖維化是心力衰竭和心臟肥大的重要特征，目前，對(duì)于心肌梗死理想的治療方式就是抑制機(jī)體纖維化水平，促進(jìn)機(jī)體心肌再生。因此，對(duì)于控制心肌梗死后機(jī)體心肌纖維化水平對(duì)于改善心臟功能和心臟重構(gòu)等具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可降低心肌梗死小鼠心肌組織LVESd、LVEDd，同時(shí)降低心肌梗死小鼠CWI、心肌羥脯氨酸含量、SOD、膠原容積分?jǐn)?shù)和SEC61α蛋白相對(duì)表達(dá)水平，升高小鼠LVEF、LVFS、MDA水平。

丹參屬于唇形科中的一種鼠尾草屬植物，具有抑制血小板聚集、擴(kuò)血管、強(qiáng)心、抗炎癥等功效[10]。目前，由丹參制成的丹參注射液已被廣泛用于婦科疾病和心血管疾病的治療中，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可通過對(duì)心臟的保護(hù)作用和其抗氧化作用達(dá)到抑制機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)的心臟肥大[11]。丹參素的抗氧化和心臟保護(hù)作用可用于抑制機(jī)體心臟肥大[12]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參素能通過TGF-β1/Smad3通路，達(dá)到抑制機(jī)體腎纖維化的結(jié)果，在其肝纖維化的治療中亦具有顯著的防治效果[13]。在對(duì)壓力復(fù)合小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，壓力負(fù)荷小鼠具有顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在此過程中機(jī)體產(chǎn)生較多的超氧化物，刺激機(jī)體信號(hào)通路的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞的大量增殖，而丹參素可顯著降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少機(jī)體膠原蛋白的合成，的同時(shí)降低纖維化水平，達(dá)到改善小鼠心功能的作用[14]。在利用異丙腎上腺素建立的小鼠纖維化的模型中，發(fā)現(xiàn)其CVF、CWI及Hydro均顯著增加，而采用降纖維化藥物作用后，以上指標(biāo)均顯著下調(diào)[15]。研究證實(shí)機(jī)體氧自由基的大量產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化但應(yīng)的發(fā)生是導(dǎo)致心肌纖維化水平發(fā)展的重要因素[16]。SOD時(shí)氧自由基消長(zhǎng)情況的直接反映指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)纖維化時(shí)，SOD活性會(huì)明顯降低，從而促使氧自由基的堆積，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化成羥自由基后可致使心肌細(xì)胞膜出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化作用，最終導(dǎo)致心肌損傷[17]。而MDA作為脂質(zhì)過氧化物，在一定情況下可用于間接反映機(jī)體的氧自由基的產(chǎn)生情況[18]。在對(duì)葛根素對(duì)心肌梗死小鼠作用的研究中發(fā)現(xiàn)，葛根素可通過增強(qiáng)小鼠心肌組織SOD活性，降低MDA水平，達(dá)到抑制機(jī)體纖維化的作用[19]。

綜上所述，丹參素可通過抗氧化、心臟保護(hù)及與降低SEC61α蛋白表達(dá)等功效，達(dá)到改善心肌梗死后出現(xiàn)的心肌纖維化的目的。