胸腔積液GeneXpert MTB/RIF對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值研究

文玉琪 崔丹 劉朋沖 趙杰 李志惠

胸腔積液常見的原因之一為結(jié)核性胸膜炎，早期診斷對于有效治療和控制該疾病至關(guān)重要。結(jié)核性胸膜炎的診斷基于患者臨床表現(xiàn)、影像學特征和實驗室檢查幾個方面，其中實驗室檢查包括細胞學、生物化學和細菌學檢查和胸膜活檢[1]。從患者的胸腔積液的抗酸染色涂片檢查及培養(yǎng)檢查找到結(jié)核菌的陽性率比較低，分別約為10%和20%，并且結(jié)核菌培養(yǎng)的方法需要的時間也較長(4～8周)[2]。胸膜活檢是一種侵入性的手術(shù)，花費高，創(chuàng)傷性大，不適用于所有患者，此外，胸膜組織活檢進行組織學檢查可能仍有20%左右的假陰性率[3]。目前結(jié)核性胸膜炎在診斷方面仍然具有挑戰(zhàn)性。一些生化指標，如腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)已被證明是一種有價值的生化標記物，在輔助診斷結(jié)核性胸膜炎方面的敏感性和特異性相對較好，在結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷中應(yīng)用較為廣泛。如若結(jié)核性胸膜炎診斷不及時，可能會延遲有效的醫(yī)學干預(yù)，而延遲抗結(jié)核治療可能導(dǎo)致胸膜增厚或結(jié)核性膿胸，而最后需要手術(shù)治療。所以，目前急需研發(fā)高敏感、高特異并且快速的工具來輔助診斷結(jié)核性胸膜炎。核酸擴增測試技術(shù)的進步大大縮短了結(jié)核病診斷的時間，其中GeneXpert MTB/RIF是世界衛(wèi)生組織推薦的、快速并且自動化的核酸擴增方法，在檢測痰標本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物和利福平耐藥性上應(yīng)用較為廣泛[4]，自問世以來，它輔助診斷結(jié)核病的價值備受關(guān)注，但是筆者發(fā)現(xiàn)用其檢測來輔助診斷結(jié)核性胸膜炎的研究相對較少。本研究評估了胸腔積液中的GeneXpert MTB/RIF在診斷結(jié)核性胸膜炎方面的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年11月至2020年11月在河北省胸科醫(yī)院進行治療的胸膜炎患者共128例，其中結(jié)核性胸膜炎78例(結(jié)核組)，男62例(79.5%)，女16例(20.5%)；年齡中位數(shù)為52(35，67)歲；非結(jié)核性胸膜炎50例(非結(jié)核組)，其中男32例(64.0%)，女18例(36.0%)；年齡中位數(shù)為61(43.75，72)歲。2組患者的年齡和性別比差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 2組患者的一般資料分析

1.2 判斷標準 結(jié)核組使用綜合參考標準(composite reference standard，CRS)進行判斷，包括臨床表現(xiàn)、常規(guī)生化檢測、胸腔積液抗酸染色、組織病理學及抗結(jié)核治療的反應(yīng)[5]。非結(jié)核組患者中表現(xiàn)為惡性胸腔積液的患者都有病理細胞學的結(jié)果進行證實，肺炎旁積液通過常規(guī)的化驗、檢查和治療效果來診斷。進行檢測前已獲得所有納入患者的知情同意。

1.3 方法 納入的患者都需要經(jīng)過相應(yīng)的檢查來證實含有可以進行抽取的胸腔積液，在無菌操作的原則下行胸腔穿刺的操作，并留取適當量的胸腔積液。

1.3.1 胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測:取20 ml胸腔積液進行離心，將裂解液加入到離心后的沉淀中，振蕩混勻1 min，靜置15 min。將處理后樣本緩慢加入Xpert反應(yīng)盒內(nèi)(購自美國的Cepheid公司)；上機檢測，在2 h后進行檢測結(jié)果的讀取。

1.3.2 TB-DNA檢測:使用PCR-熒光探針的檢測方法，對胸腔積液進行結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測，具體操作嚴格按照試劑盒(產(chǎn)自成都博奧晶芯生物科技有限公司)說明進行。

1.3.3 ADA活性檢測:取新鮮的胸腔積液5 ml，以3 000 r/min的速度離心10 min，取得上清液體用酶法測定ADA活性，參照試劑盒的說明進行診斷，試劑盒購自寧波美康公司。

1.3.4 結(jié)核菌培養(yǎng):采用氫氧化鈉溶液對采集的胸腔積液標本反應(yīng)20 min，隨后加入緩沖液混勻后離心處理，去上清后加入緩沖液重懸沉淀物，混勻后取0.5 ml接種于MGIT960液體快速結(jié)核菌培養(yǎng)基中，并在BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)(Becton Dickinson公司，美國)培養(yǎng)。具體步驟嚴格按照使用說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 2組患者胸腔積液ADA檢測結(jié)果 結(jié)核組胸腔積液ADA中位水平44(26，59.25)U/L，高于非結(jié)核性胸膜炎組患者的ADA中位水平11.4(6，15.75)U/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者胸腔積液ADA檢測結(jié)果

2.2 胸腔積液ADA受試者工作特征曲線分析 受試者的工作特征(ROC)曲線的分析顯示，ADA用于診斷結(jié)核性胸膜炎的ROC曲線下的面積為0.916。本研究中，胸腔積液ADA在面積最大時ROC曲線拐點值為24.5 U/L，在該臨界值下，診斷的敏感性為79.5%，特異性為88%。見圖1。

圖1 胸腔積液ADA受試者工作特征曲線分析

2.3 胸腔積液TB-DNA、結(jié)核菌培養(yǎng)及GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果及比較 結(jié)核組與非結(jié)核組患者的胸腔積液標本均行TB-DNA、結(jié)核菌培養(yǎng)及GeneXpert MTB/RIF檢測，結(jié)核組患者胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測陽性率(26.9%)，分別高于胸腔積液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率(16.7%)及胸腔積液TB-DNA檢測的陽性率(2.6%)(χ2=2.407，P>0.05；χ2=18.41，P<0.05)。見表3。

表3 胸腔積液TB-DNA、結(jié)核菌培養(yǎng)及GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果比較

2.4 胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果 結(jié)核組與非結(jié)核組患者的胸腔積液均進行了GeneXpert MTB/RIF檢測，其中結(jié)核組檢出陽性的例數(shù)為21例，陰性例數(shù)為57例；非結(jié)核組患者檢測結(jié)果均為陰性。計算胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度為26.9%，特異度為100%。

2.5 胸腔積液ADA與GeneXpert MTB/RIF并聯(lián)檢測價值 將胸腔積液ADA與GeneXpert MTB/RIF并聯(lián)檢測，結(jié)果顯示胸腔積液ADA+GeneXpert MTB/RIF的敏感度(82.1%)，高于胸腔積液ADA活性檢測(79.5%)及胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測(26.9%)(χ2=66.117，P<0.05；χ2=6.286，P<0.05)。見表4。

表4 胸腔積液ADA與GeneXpert MTB/RIF并聯(lián)檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷性能

3 討論

在中國40%的胸腔積液是由結(jié)核性胸膜炎引起的，該病的臨床癥狀不典型，可以出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀，有時也可出現(xiàn)呼吸困難[6]。結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核桿菌直接侵入發(fā)生的炎癥或者是胸膜對結(jié)核菌的菌體相關(guān)的成分發(fā)生了遲發(fā)型的變態(tài)反應(yīng)[7]，故此類患者胸腔積液中常常缺乏結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌的分離較為困難，早期確診也十分困難。與培養(yǎng)、染色和活檢相比，胸膜生物標志物是一種廉價、無創(chuàng)、快速、客觀的結(jié)核性胸膜炎診斷工具[8]，如胸腔積液ADA水平檢測目前應(yīng)用最為廣泛，但由于腺苷脫氨酶是由胸膜腔內(nèi)T淋巴細胞的浸潤激活的，因此較少的結(jié)核分枝桿菌可能導(dǎo)致較弱的免疫反應(yīng)和較低的腺苷脫氨酶水平。其他因素，包括年齡和吸煙史，也可能影響ADA水平[9]。分子生物學不斷的發(fā)展，為快速診斷結(jié)核病及快速檢測結(jié)核菌的耐藥性提出了新的方法，其中痰及肺泡灌洗液標本GeneXpert MTB/RIF研究較為廣泛，其高度敏感性及特異性也得到了廣泛認可，在胸腔積液標本中研究相對較少。本研究回顧性地分析了胸腔積液中ADA、TB-DNA、GeneXpert MTB/RIF診斷及鑒別結(jié)核性胸膜炎的價值。我們發(fā)現(xiàn)以上三種檢測方法中胸腔積液ADA檢測的敏感度最高，而且有著較高的特異度；胸腔積液內(nèi)的TB-DNA、GeneXpert MTB/RIF的特異度高，但敏感度均較低，其中胸腔積液GeneXpert MTB/RIF法診斷結(jié)核性胸膜炎方面敏感度比胸腔積液TB-DNA檢測明顯要高；胸腔積液ADA與胸腔積液GeneXpert MTB/RIF并聯(lián)檢測可以提高診斷的敏感度。

ADA作為嘌呤核苷代謝中的酶，淋巴細胞的ADA含量相對高，患有結(jié)核性胸膜炎時，刺激免疫系統(tǒng)使得淋巴細胞增多，故胸腔積液中ADA含量增高。ADA水平檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷有輔助的作用，Aggarwal等[10]評估總結(jié)了ADA診斷結(jié)核性胸膜炎中的敏感性和特異性，發(fā)現(xiàn)胸腔積液內(nèi)ADA水平診斷結(jié)核性胸膜炎的總的敏感性、特異性是0.92(95%可信區(qū)間0.90～0.93)、0.90(95%可信區(qū)間0.88～0.91)，但由于各項研究采用的參考標準不一致，且各地區(qū)患病率的不同，故ADA診斷界值具有可變性，而無法得到可靠的ADA參考閾值。胸腔積液ADA水平的上升和其他病因也有關(guān)系，如膿胸和肺炎旁積液，使用ADA診斷可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11]。相關(guān)研究表明，結(jié)核性胸膜炎患者也可出現(xiàn)低ADA活性的情況，Sae等[12]研究顯示老年或危重或多器官衰竭的患者的ADA活性相對低；當艾滋病合并結(jié)核性胸膜炎時，免疫系統(tǒng)缺陷使得淋巴細胞的反應(yīng)力下降，導(dǎo)致胸腔積液內(nèi)的ADA水平不能得到顯著上升[13]；結(jié)核性胸膜炎早期胸腔積液中ADA水平也可能處于低水平，在以上情況下使用ADA活性方法診斷可能導(dǎo)致假陰性診斷。本研究中，結(jié)核組胸腔積液ADA中位水平44(26,59.25)U/L，比非結(jié)核性胸膜炎組ADA中位水平11.4(6,15.75)U/L升高明顯，有統(tǒng)計學的差異；受試者的工作特征(ROC)曲線分析顯示，ADA用于結(jié)核性胸膜炎診斷的ROC曲線下的面積為0.916，對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值較高。胸腔積液ADA在面積最大時ROC曲線拐點值為24.5U/L，以此為臨界值，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為79.5%，特異度為88%。鑒于使用ADA診斷方法有可能出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果，臨床上在制定臨界值時需要根據(jù)患者年齡、免疫狀態(tài)等綜合考慮，而且為提高鑒別診斷的準確性，多種檢測手段常常聯(lián)合來診斷。

結(jié)核分枝桿菌DNA檢測是一種通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法來進行結(jié)核分枝桿菌基因DNA擴增，可為結(jié)核分枝桿菌感染提供直接證據(jù)，以PCR為基礎(chǔ)的檢測呼吸道標本中結(jié)核分枝桿菌DNA的技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，然而，PCR技術(shù)的不斷改進以及研究所定參考標準的不同，其在診斷準確性上也不全相同，尤其是在非呼吸道標本如胸腔積液，診斷方面使用存在很大爭議。Mulalo等[2]評價實時聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qPCR)和胸水腺苷脫氨酶(ADA)水平在結(jié)核性胸腔積液診斷作用的研究發(fā)現(xiàn)TB-PCR和ADA的敏感性分別為67%和80%；然而在Islam等[14]研究采用傳統(tǒng)PCR檢測，PCR陽性率僅6%。在我們的研究中，采用PCR-熒光探針法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，以綜合參考標準為參照，只有2名結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液PCR檢測結(jié)果呈陽性，診斷敏感性2.6%，特異性100%，本研究結(jié)果提示胸腔積液PCR-熒光探針法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA敏感性較差，不適合作為結(jié)核性胸膜炎常規(guī)檢測方法。GeneXpert MTB/RIF是經(jīng)世界衛(wèi)生組織推薦的，對結(jié)核病有快速診斷價值的分子生物學的方法，以半巢式實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)，全自動地檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥。Li等[15]的研究顯示GeneXpert MTB/RIF對肺組織、腦脊液、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液的敏感性為100%，其次是痰(88.5%)、肺泡灌洗(85.7%)、支氣管鏡分泌物(81.2%)，胸水敏感性最低，僅為15.0%，但明顯高于AFB(0)。Han等[3]研究顯示胸腔積液Xpert MTB/RIF法的敏感性為27.4%，明顯高于胸腔積液涂片(14.3%，χ2=20.65，P≤0.001)。Sehgal等[16]對GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性胸腔積液(TPE)診斷中的作用進行了一項薈萃分析，發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)為參照物，Xpert MTB/RIF的敏感性和特異性分別為51.4%和98.6%，以CRS為參照物，分別為22.7%和99.8%。Wang等[1]研究以綜合參考標準進行結(jié)核性胸膜炎診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF(19.23%)和涂片(1.44%)相比具有更高的敏感性。本研究以CRS為參照物，胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測敏感度為26.9%，特異度為100%，與上述結(jié)論較為一致。從現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)來看，GeneXpert MTB/RIF診斷結(jié)核性胸膜炎的方面表現(xiàn)出的敏感性不夠高，考慮本研究中多數(shù)的患者的胸腔積液可能是胸膜經(jīng)結(jié)核菌菌體的成分刺激而發(fā)生了遲發(fā)型的變態(tài)反應(yīng)，而不是結(jié)核菌直接侵入引起的，故該類患者胸腔積液中的結(jié)核分枝桿菌可能較少。本研究中胸腔積液GeneXpert MTB/RIF與胸腔積液TB-DNA診斷的特異性均為100%，相比而言，胸腔積液GeneXpert MTB/RIF具有更高的敏感性，且因其檢測需要的時間短，而敏感性與結(jié)核菌培養(yǎng)相當，對結(jié)核性胸膜炎的診斷具有一定價值。

總之，胸腔積液ADA活性檢測的敏感性(79.5%)和特異性(88%)均較好，目前仍是診斷結(jié)核性胸膜炎的有用方法。PCR-熒光探針法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA的敏感性較低，不應(yīng)作為結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)檢測方法，比較而言，胸腔積液GeneXpert MTB/RIF診斷價值更高，與胸腔積液ADA活性檢測相結(jié)合，可以提高診斷結(jié)核性胸膜炎的效能，在有條件的地區(qū)，GeneXpert MTB/RIF與ADA活性的測量可以同時進行。本研究也存在一些局限性，研究的樣本量相對較少，采用綜合參考標準而不是以胸膜液結(jié)核菌培養(yǎng)或胸膜組織學作為參考標準，是一項單中心的回顧性研究，可能會限制我們結(jié)果的普遍性。因此，有必要在更大的人群中進行多中心前瞻性研究，以進一步驗證其診斷性能。