ABCC11基因多態(tài)性對非小細(xì)胞肺癌患者S-1輔助化療預(yù)后的價值分析

邢國柱 沈會華 李悟

肺癌是世界上最常見的癌癥相關(guān)死亡原因[1]。為了預(yù)防肺癌復(fù)發(fā)，臨床上已建立了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)術(shù)后ⅠB～ⅢA期患者的輔助化療方案[2,3]。目前所使用的輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案是靜脈注射順鉑，另一種輔助性化療藥物為尿嘧啶-喃氟啶，是5-氟尿嘧啶(5-Fu)的前體藥物，這種口服藥物也已被證明也對IB期肺腺癌的治療有效[4]。S-1是另一種口服氟嘧啶衍生物，由替加氟、5-氯-2,4-二羥基吡啶(CDHP)和氧酸鉀(Oxo)3種成分組成[5]。以S-1為基礎(chǔ)的化療在輔助治療中起到的積極作用已在多種癌癥治療中得到證實，包括胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等[6-8]。ABCC11基因位于16號染色體上，是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的一員，編碼多耐藥相關(guān)蛋白8(MRP8)，其對腋窩頂泌腺和初乳分泌功能具有重要的意義，且已有研究證明其參與調(diào)節(jié)5-Fu代謝[9,10]。5-Fu及其衍生物在細(xì)胞內(nèi)被代謝為5-氟-2’-脫氧尿苷5’-單磷酸(FdUMP)，F(xiàn)dUMP被ABCC11/MRP8主動轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。ABCC11基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，例如538G/A，G180R，對分泌位置及功能具有重要作用，并且決定耳垢干濕性[11,12]。A/A等位基因型對應(yīng)于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型對應(yīng)于濕性耳垢。因此，這些數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)耳垢類型的SNP538可能預(yù)測5-Fu的療效。本研究為了闡明S-1輔助化療后，ABCC11基因多態(tài)性對ⅠB～ⅢA期NSCLC預(yù)后的影響，究了肺癌患者5年生存率及其與臨床病理因素的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年2月至2015年9月在本院診治的60例NSCLC患者作為研究對象，其中男40例，女20例；平均年齡(58.4±10.2)歲，患者均要求符合以下標(biāo)準(zhǔn)：有組織學(xué)證據(jù)證明患者為非小細(xì)胞肺癌；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)/美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC) 1997年第5版指南，非小細(xì)胞肺癌完全切除后病理分期為ⅠB、Ⅱ或ⅢA；除手術(shù)外，未接受其他治療；年齡20～80歲，有足夠的口服攝取量，且表現(xiàn)狀態(tài)(PS)為0或1[14]。所有患者進(jìn)行了肺葉切除手術(shù)?；颊呔炗喼橥鈺?，本研究同時經(jīng)醫(yī)院倫理道德委員會通過。見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者的基本特征

1.2 方法

1.2.1 治療計劃如下：化療包括8個療程，根據(jù)患者體表面積(BSA)的不同，S-1的給藥劑量為80～120 mg/d。BSA <1.25 m2時,80 mg/d；1.25 m2≤BSA <1.5 m2時，100 mg/d，BSA≥1.5 m2，120 mg/d。S-1在術(shù)后4周內(nèi)開始口服，2次/d，飯后服用。

1.2.2 使用QIAamp DNA迷你試劑盒(Qiagen,上海)按照說明書中描述的方法，從2～3個連續(xù)的10 mm切片中提取DNA。采用突變富集—多聚酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)對突變熱點進(jìn)行了分析。

1.2.3 胸苷合酶(TS)、乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(OPRT)、DPD的免疫組化染色。制備5 mm厚的腫瘤切片進(jìn)行免疫組化染色。采用1∶1 000濃度的原代多克隆抗體(APExBIO，上海)結(jié)合DPD、OPRT和TS。以生物素化抗兔免疫球蛋白G和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(Bersee，北京)為二抗檢測DPD。采用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector，上海)作為檢測TS和OPRT的二抗。使用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺觀察抗體結(jié)合。腫瘤細(xì)胞免疫染色強(qiáng)度分為：0(無染色)、D1(弱染色)、D2(明顯染色)、D3(強(qiáng)染色)。0級和1級進(jìn)一步分為陰性，2級和3級為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用JMP 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier方法預(yù)測無復(fù)發(fā)生存期(RFS)和總生存期(OS)的時間-事件函數(shù)。RFS定義為從開始治療之日起至最早出現(xiàn)復(fù)發(fā)之日或死亡之日(以先發(fā)生者為準(zhǔn))。OS定義為從開始治療之日起至死亡或最后一次接觸之日止的時間。log-rank檢驗用于檢驗預(yù)測時間-事件曲線之間可能存在的差異。單因素的預(yù)后相關(guān)性由多因素Cox回歸分析確定。采用χ2檢驗分析復(fù)發(fā)和臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5年生存率與臨床病理因素相關(guān)性分析 在隨訪的60例患者中，16例死亡，44例分析時仍存活。5年的OS為73.3%。在16例死亡患者中，有11例在死亡前有復(fù)發(fā)記錄，其余4例患者中，1例死于膽管癌，1例死于腦梗死，2例死于惡性淋巴瘤，1例死于腹膜癌。5年的RFS為69.5%。見圖1。

圖1 ⅠB～ⅢA期NSCLC患者接受S-1化療后的5年OS(a)和RFS(b)

2.2 5年單因素分析 根據(jù)臨床病理特點列出了5年的OS和RFS。OS單因素分析發(fā)現(xiàn)，鱗狀細(xì)胞癌患者的OS比肺腺癌患者短(P=0.032)；腫瘤≥34 mm

的患者相較于腫瘤≤33 mm的患者OS也短 (P=0.013)。RFS單因素分析發(fā)現(xiàn)，功能狀態(tài)評分(PS)≥1 (P=0.031)、淋巴管浸潤(P=0.005)、血管浸潤(P=0.003) 以及A/A型SNP538 (P=0.012)均表現(xiàn)出較短的生存時間。見表2。

表2 根據(jù)臨床病理特征對非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行5年生存率分析

2.3 ABCC11基因與患者預(yù)后的關(guān)系 從接受S-1治療的60例患者中挑選出40例療效達(dá)到或超過70%的患者，對其5-年存活率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，A/A型SNP538(P=0.003)、TS 免疫組化結(jié)果為陰性(P=0.018)以及PS≥1(P=0.026)均為RFS較差的顯著預(yù)測因子。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)只有A/A型SNP538表現(xiàn)出顯著的危險比(P=0.002)。見圖2，表3。

表3 根據(jù)40例S-1療效較好的患者的臨床病理特點進(jìn)行單因素和多因素RFS分析

3 討論

本研究中，S-1治療NSCLS后5年OS和RFS發(fā)生率較高；ⅠB至ⅢA期患者的OS和RFS分別為73.3%和69.5%，與以往的研究結(jié)果[3]相當(dāng)。雖然S-1在術(shù)后輔助治療中具有較高的療效，但是其確切作用機(jī)制尚不明晰。眾所周知，尿嘧啶-喃氟啶的毒性極低，因此很適合作為口服藥物長期(2年)使用，在此期間，它達(dá)到足夠量的5-Fu，進(jìn)而防止癌癥復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。由于S-1是一種類似的口服氟嘧啶，其1年的給藥可能通過相同的機(jī)制導(dǎo)致良好的預(yù)后。以S-1為基礎(chǔ)的化療在輔助治療中起到的積極作用已在多種癌癥治療中得到證實，包括胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等[9-11]。與此同時，研究者還開展了基于S-1的NSCLC ⅠB期至ⅢA期輔助化療的可行性研究，研究表明基于S-1的輔助化療在ⅠB至ⅢA期NSCLC中均是可行的[13-15]。此外，口服藥物治療能夠在門診進(jìn)行，可以維持患者的生活質(zhì)量。

就治療策略而言，以S-1為基礎(chǔ)的治療作為術(shù)前輔助化療也具有一定的優(yōu)勢。在S-1治療過程中，5-Fu代謝物FdUMP與TS形成極其穩(wěn)定的三元復(fù)合物，阻斷dUMP的甲基化，并且也阻止了dUMP轉(zhuǎn)化為DNA合成所必需的dTMP[16,17]。因此，S-1抗癌作用的主要機(jī)理是抑制細(xì)胞分裂。另一方面，鉑以幾種不同的方式與DNA交聯(lián)，通過干擾有絲分裂影響細(xì)胞分裂，破壞DNA結(jié)構(gòu)，并引發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡[18]。鑒于這些藥物具有不同的抗癌機(jī)制，以S-1為主要的輔助化療手段，復(fù)發(fā)后選擇鉑偶聯(lián)治療可能會有更好的療效。

本研究的生存分析表明，較低的PS和淋巴管及血管浸潤與較短的RFS時間有關(guān)。這些結(jié)果與以往研究的結(jié)果一致，血管浸潤性腫瘤具有侵襲性生長以及轉(zhuǎn)移的潛能，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良[19]。A/A型SNP538也與較短的RFS有關(guān)，多因素生存分析表明，A/A型SNP538表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上較為顯著的危險比。已有研究表明,ABCC11基因中的SNP538決定了耳垢的類型[19]。A/A等位基因型對應(yīng)于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型對應(yīng)于濕性耳垢。由于G/G或G/A型SNP538患者沒有復(fù)發(fā)，這一結(jié)果顯示耳垢類型可以作為基于S-1的輔助化療療效的生物標(biāo)志物。這些等位基因的頻率存在較大的種族差異[20]，這表明基于S-1化療的療效也存在種族差異。然而，ABCC11基因的SNP538影響S-1輔助化療患者預(yù)后的機(jī)制尚難解釋。在一項基于細(xì)胞的研究中顯示，ABCC11通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物的外流，直接對培美曲塞產(chǎn)生耐藥性。此外，A/A組培美曲塞的IC50較G/G或G/A組顯著降低，說明A/A型SNP538患者對培美曲塞更為敏感[21]。在本研究中，A/A型患者的RFS率低于G/A或G/G型患者。有可能是因為S-1在活細(xì)胞中的積累，影響A/A型SNP538患者體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致癌癥的復(fù)發(fā)。低TS的表達(dá)與復(fù)發(fā)之間也存在關(guān)聯(lián)。本研究的結(jié)果表明，接受S-1治療的患者中，高TS表達(dá)組比低表達(dá)組表現(xiàn)出更好的RFS。以往也有很多研究表明，高TS表達(dá)確實可以預(yù)測良好的預(yù)后。Fujiwara等[21]利用老鼠模型，發(fā)現(xiàn)在高TS表達(dá)水平的胃癌中，S-1比5-Fu和尿嘧啶-喃氟啶的抗腫瘤療效更好。我們推測S-1較高的DPD抑制作用增加了5-Fu代謝物的細(xì)胞內(nèi)水平，并通過TS失活誘導(dǎo)TS成癮性癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

綜上所述，本研究的5年生存率分析表明ABCC11基因中的A/A型SNP538是術(shù)后患者接受S-1輔助治療是否會復(fù)發(fā)的重要預(yù)測因子。由于A/A型SNP538對應(yīng)于干型耳垢，因此基于S-1的輔助化療可能因耳垢類型的不同而產(chǎn)生個性化差異。