轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在缺氧性肺血管重構(gòu)中的作用機(jī)制

陳依林 李光才

轉(zhuǎn)錄因子是抗氧化反應(yīng)的重要的上游調(diào)節(jié)劑，它可以維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)并減少嚴(yán)重的氧化損傷[1]。在最近的20年中，核因子-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)的發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激在許多關(guān)鍵疾病的發(fā)病機(jī)制中作用的證據(jù)不斷增加[2]。Nrf2穩(wěn)態(tài)受細(xì)胞質(zhì)抑制劑Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1的調(diào)節(jié)，以響應(yīng)內(nèi)部清潔蛋白需求或氧化劑，異源生物、致癌物、抗氧化劑和化學(xué)預(yù)防劑的外源刺激，不僅有助于維持細(xì)胞氧化還原平衡，而且還有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和死亡、免疫力、新陳代謝、選擇性蛋白質(zhì)降解、發(fā)育和致癌作用[3]。小腸缺血/再灌注(intestinal ischemia/reperfusion，IIR)術(shù)中并發(fā)癥可引起繼發(fā)性血管疾病和許多相關(guān)的生理狀況，主要與缺血組織和炎性介質(zhì)釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)有關(guān)[4]。因此，IIR可能導(dǎo)致敗血癥，全身性炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[5]。已知Nrf2可以激活各種抗氧化反應(yīng)元件依賴性基因響應(yīng)氧化應(yīng)激[6]。Nrf2也參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和其他組織床的缺血性血管新生[7]。Nrf2被認(rèn)為在缺氧時(shí)會(huì)增加炎癥和損傷，從而在與氧化應(yīng)激相關(guān)的肺損傷中起保護(hù)作用[8]。Sirt1是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的脫乙酰酶蛋白酶，被認(rèn)為通過脫酰作用以及與幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子的相互作用而參與了許多調(diào)控過程[9]。上調(diào)Sirt1的水平會(huì)增加Nrf2的核易位，進(jìn)而抑制絲裂原激活的蛋白激酶磷酸化，并提供針對(duì)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[10]。本研究探討Nrf2/Sirt1通路在調(diào)節(jié)氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)后肺損傷后inNrf2缺乏的Nrf2敲低人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)的血管重建和急性肺損傷的調(diào)節(jié)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠:在實(shí)驗(yàn)中使用C57BL/6J小鼠(周齡10周左右)和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠，所有小鼠具有相同的遺傳背景。使用日本MEXT的Project進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。以12 h的明/暗周期將小鼠保持在受控溫度(21±2)℃和濕度(60±5)%下。小鼠可隨意獲取標(biāo)準(zhǔn)食物。

1.1.2 小鼠肺損傷模型構(gòu)建:用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，并在手術(shù)過程中自發(fā)呼吸。通過中線切口打開麻醉小鼠的腹壁。腸系膜上動(dòng)脈暴露并被動(dòng)脈瘤夾夾住。到腸的血流中斷90 min，釋放以重新建立血流。假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù)，除了夾住腸系膜上動(dòng)脈。手術(shù)后腹膜內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液(1.0 ml)使所有小鼠復(fù)蘇。再灌注6 h后處死動(dòng)物并收獲組織。將組織在液氮中速凍并保存在-80℃直至分析。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組:將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分配到以下四組(每組n=10)：WT小鼠對(duì)照組(野生型小鼠不做手術(shù)處理)；WT小鼠損傷組(該組小鼠進(jìn)行腸缺血/再灌注手術(shù)處理，進(jìn)行肺損傷模型構(gòu)建)；Nrf2-/-小鼠損傷組(Nrf2-/-小鼠進(jìn)行腸缺血/再灌注手術(shù)處理)；Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組(Nrf2抑制表達(dá))；Sirt1過表達(dá)組(用Sirt1慢病毒載體轉(zhuǎn)染PMVEC)。

1.1.4 醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題:所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案下進(jìn)行，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8測定細(xì)胞增殖:細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Sigma，日本)用于檢測NSCLC細(xì)胞的增殖。將細(xì)胞以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，并在5%CO2中于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以粘附細(xì)胞。向每個(gè)孔中添加10 μl細(xì)胞增殖試劑CCK-8，混合，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。雙波長酶標(biāo)儀用于測量450～490 nm 的檢測波長和600～650 nm的參考波長(貝克曼庫爾特，美國)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都設(shè)置了3個(gè)平行重復(fù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧葡萄糖剝奪和復(fù)氧人PMVEC從科學(xué)細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)室(目錄號(hào)：3 000)購買。為了進(jìn)行OGD/R，將細(xì)胞在無葡萄糖的DMEM中培養(yǎng)。將它們?cè)谘a(bǔ)充有0.5 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MgCl2的PBS中洗滌，并置于厭氧室(5%CO2、95%N2； Memmert； Schwabach，德國)中以誘導(dǎo)OGD。8 h后，將培養(yǎng)基替換為ECM，并使平板在常氧室(37℃，5%CO2)中生長，進(jìn)行24 h的復(fù)氧。Sirt1載體對(duì)PMVEC的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，如先前所述，用Sirt1慢病毒載體轉(zhuǎn)染PMVEC。將PMVECs以每孔2×105的密度鋪在6孔板中，感染感染復(fù)數(shù)(MOI)為20的慢病毒載體。通過在10 ml的分選緩沖液(含2%FBS，1 mmol/L EDTA的D-PBS)和50 U/ml DNAse中上下吸打，將肺組織解離。樣品在搖動(dòng)下于37℃孵育10 min，通過100 μm，70 μm和40 μm細(xì)胞過濾器轉(zhuǎn)移到50 ml管中。將過濾后的懸浮液轉(zhuǎn)移至15 ml試管中，并在4℃下以550×g的轉(zhuǎn)速離心5 min以沉淀細(xì)胞。除去上清液，并將細(xì)胞重懸于10 ml分選緩沖液中，并通過在37℃下振蕩孵育1 h使其恢復(fù)。

1.2.3 組織學(xué)檢查:在4 mm蘇木精和曙紅(HE)染色的石蠟包埋切片中確定缺血-再灌注損傷。根據(jù)肺泡充血、出血、水腫和炎性細(xì)胞在空域或血管壁浸潤的綜合評(píng)估，使用五點(diǎn)量表對(duì)急性肺損傷進(jìn)行評(píng)分。盲目使用0-4(最低至最高嚴(yán)重性)評(píng)分系統(tǒng)。肺纖維化是通過使用Image Pro-Plus 6.0軟件對(duì)Masson的Trichrome陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析來測量的。圖像是用連接與數(shù)碼相機(jī)(Optronics DEI-470；加利福尼亞州戈萊塔)捕獲的。使用評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估肺損傷程度。根據(jù)該評(píng)分系統(tǒng)，將肺泡和間充質(zhì)的水腫，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，肺泡出血和肺不張的等級(jí)分為0～4級(jí)。等級(jí)：0級(jí)，正常，<所占空間的15%被組織和> 85%的肺泡間隙占據(jù)；1級(jí)，15%～25%的空間被組織占據(jù)，而76%～85%的空間被肺泡占據(jù)；2級(jí)，組織占26%～50%，肺泡間隙占51%～75%；3級(jí)，組織占51%～75%，肺泡間隙占26%～50%；4級(jí)，組織占76%～100%，肺泡間隙占0～25%。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡分析:通過先前描述的方法從PMVEC制備核提取物。通過刮擦在含有磷酸酶抑制劑的冰冷的PBS中收集細(xì)胞，并通過離心沉淀在1 000×g下5 min。將沉淀重懸于500 ml 1×低滲緩沖液中，在冰上孵育15 min，添加去污劑(25 ml)并高速渦旋30 s。將懸浮液在4℃離心(14 000×g，20 min)；將核沉淀重懸于裂解緩沖液中(50 ml)，并在冰上孵育15 min。將該懸浮液進(jìn)一步離心(14 000×g)10 min，將等分的上清液(核提取物)儲(chǔ)存在-80℃進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過BCA蛋白質(zhì)測定法定量核提取物中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡通過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行。通過SDS-PAGE分離總細(xì)胞裂解液或肺組織中的蛋白質(zhì)(30 mg)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過化學(xué)發(fā)光(ECL;Amersham)觀察條帶，暴露于X射線膠片并使用ImageJ進(jìn)行光密度測定定量。

1.2.5 肺膠原定量:切斷腹主動(dòng)脈后，用無菌0.9%氯化鈉溶液(15 ml)灌注肺血管，在肺門切開左肺，勻漿，在65%三氯乙酸中孵育(Fisher Scientific，賓夕法尼亞州匹茲堡)在冰上。離心并吸出上清液后，將組織沉淀重懸于12 N HCl中，并在110℃下烘烤過夜。將變性的組織在ddH2O中重新配制，將等分試樣(200 ml)與在10%異丙醇和0.5 mmol/L乙酸鈉中的1.4%氯胺T于室溫孵育20 min。加入1 mmol/L 4-(二甲基氨基)-苯甲醛(500 ml； Sigma-Aldrich)，并將該懸浮液在65℃下溫育15 min。對(duì)于每個(gè)樣品，一式三份地測量540 nm處的吸光度。 從氯胺反應(yīng)開始，同時(shí)使用0～500 mg/ml反式4-羥基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich)同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 RNA提取和實(shí)時(shí)PCR:使用RNeasy minikit(QIAGEN，德國漢堡)提取總RNA。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR，將RNA(2 mg)反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(40 ng)的模板。放大循環(huán)反應(yīng)(40個(gè)循環(huán))如下進(jìn)行：在95℃下5 s和在60℃下30 s。根據(jù)比較閾值循環(huán)(2-DDCT)標(biāo)準(zhǔn)化靶基因的相對(duì)定量值。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 肺損傷后Nrf2的表達(dá) 通過免疫熒光染色確定肺傷后Nrf2的表達(dá)，WT小鼠損傷組較WT小鼠對(duì)照組Nrf2的熒光染色增加(P<0.05)。說明在肺損傷后Nrf2在肺組織的細(xì)胞核中大量積聚。見表2。

表2 免疫熒光染色確定Nrf2的表達(dá)

2.2 蛋白質(zhì)印跡分析 通過蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)小鼠的HIF-1α、VEGF和CD31的蛋白表達(dá)，WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組HIF-1α、VEGF和CD31的蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。表明Nrf2有利于改善血管生成。見表3。

表3 蛋白印跡分析

2.3 Nrf2對(duì)肺損傷后的調(diào)節(jié) WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組白細(xì)胞浸潤量降低(P<0.05)，Nrf2-/-小鼠損傷組較WT小鼠損傷組肺損傷評(píng)分升高(P<0.05)，WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組膠原蛋白沉淀降低(P<0.05)。見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)小鼠的肺損傷指標(biāo)檢

2.4 細(xì)胞增殖檢測 第12小時(shí) Sirt1過表達(dá)組較Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖升高(P<0.05)，第24小時(shí)Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組較 Sirt1過表達(dá)組細(xì)胞增殖降低(P<0.05)。見表5。

表5 細(xì)胞增殖檢測

2.5 RT-PCR分析 通過PCR實(shí)時(shí)分析細(xì)胞的CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達(dá)，Sirt1過表達(dá)組較Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。表明 Sirt1的過表達(dá)可誘導(dǎo)Nrf2上調(diào)，促進(jìn)NOX4介導(dǎo)的基因調(diào)控促進(jìn)人類PMVEC中的血管生成。見表6，圖1。

表6 RT-PCR實(shí)時(shí)分析CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達(dá)

3 討論

Nrf2是抗氧化反應(yīng)元件的基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與多種宿主防御功能，包括氧化還原平衡，細(xì)胞周期，免疫力，線粒體生物發(fā)生，能量代謝和致癌作用[11]。呼吸道中的Nrf2尤其重要，因?yàn)楹粑到y(tǒng)會(huì)不斷與環(huán)境壓力相接[12]。由于Nrf2被確定為模型急性肺損傷的易感基因，因此在人類疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺褂靡籽a(bǔ)充呼吸治療(例如高氧血癥，機(jī)械通氣)的Nrf2突變小鼠已證明了Nrf2在氣道中的保護(hù)能力[13]。Nrf2已參與調(diào)節(jié)多種疾病的缺血性血管新生，例如心血管疾病和缺血性視網(wǎng)膜病[14]。Nrf2也被認(rèn)為可以保護(hù)許多器官免受IIR傷害，包括肺。此外，在幾項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)Sirt1的上調(diào)可激活Nrf2[15]。我們研究了Nrf2是否參與了IIR在鼠模型中急性肺損傷的血管形成和調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)Sirt1過表達(dá)刺激的Nrf2可能在缺血后的血管新生中起重要作用IIR通過NOX4介導(dǎo)的基因調(diào)控。由Sirt1過表達(dá)刺激的Nrf2上調(diào)和易位向組織病理學(xué)變化的緩解并增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)。Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路是抵抗氧化或親電子應(yīng)激的主要細(xì)胞防御手段[16]。它通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型和組成型基因的表達(dá)與許多抗氧化反應(yīng)元件依賴基因相互作用[17]。深入了解抗氧化反應(yīng)元件誘導(dǎo)型/組成型基因的調(diào)控可能會(huì)導(dǎo)致以控制所需的質(zhì)量，例如缺血組織的血運(yùn)重建[18]。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠中Nrf2敲低抑制了IIR后的CD31，HIF-1α和VEGF表達(dá)，而Sirt1對(duì)Nrf2的上調(diào)增強(qiáng)了野生型IIR后的CD31，HIF-1α和VEGF表達(dá)。HIF-1α參與VEGF的轉(zhuǎn)錄，從而刺激缺氧或局部缺血后的新生血管形成[19]。使用視網(wǎng)膜病變的大鼠模型研究了新生血管形成，發(fā)現(xiàn)VEGF激活的NOX4導(dǎo)致了VEGF活化的VEGFR2和NOX4介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并提出Sirt1可以發(fā)揮血管生成的作用，發(fā)現(xiàn)Sirt1通過FOXO3信號(hào)通路對(duì)IIR誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用[20]。為了研究與Nrf2/Sirt1相關(guān)的血管生成，本研究評(píng)估了OGD/R后人PMVEC中Nrf2和Sirt1的調(diào)控。發(fā)現(xiàn)Sirt1過表達(dá)誘導(dǎo)Nrf2上調(diào)并易位到核內(nèi)。Nrf2的核積累與增強(qiáng)的Sirt1介導(dǎo)的CD31、NOX4和Nrf2表達(dá)有關(guān)。此外，Sirt1在細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)室之間穿梭，并調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞的生長，細(xì)胞存活和遷移相關(guān)的基因表達(dá)，以響應(yīng)生理和病理性細(xì)胞應(yīng)激。因此，Nrf2/Sirt1我們?cè)谑竽Ｐ椭杏^察到的調(diào)節(jié)血管生成在人肺內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制。

總之，我們發(fā)現(xiàn)Sirt1的過表達(dá)促進(jìn)了Nrf2向核的轉(zhuǎn)運(yùn)，并增加了鼠和人細(xì)胞模型中NOX4、HIF-1α和VEGF的表達(dá)。這導(dǎo)致鼠模型中的缺血性血管生成和增加了人類細(xì)胞中的細(xì)胞活力。當(dāng)受Sirt1刺激時(shí)，Nrf2可能通過NOX4介導(dǎo)的基因調(diào)控在血管生成中發(fā)揮重要作用。