周翔 成平 陸衡程 賀理宇
局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是臨床上常見的一種腎臟疾病的病理形態(tài)學診斷定義,以部分腎小球及(或)其毛細血管袢發(fā)生局灶化病變?yōu)橹饕±肀憩F[1,2]。蛋白尿、血尿是其主要的臨床表現,各種治療方案的效果不一,導致病情呈慢性進行性發(fā)展,最終可進展成終末期腎病(ESRD)。FSGS可見于任何年齡,但兒童及青少年更加多見,而且近年來其發(fā)生率有增高趨勢[3,4]。既往研究顯示,遺傳背景、氧化應激、炎性反應、免疫紊亂等都與其發(fā)病有關,但發(fā)病機制尚不完全明確[1,2,4,5]。所以探索和闡明其發(fā)病機制,找到其新的治療靶點,對全球衛(wèi)生健康和經濟負擔都有重大意義[6]。哺乳動物不育系20樣激酶(MST1)是Hippo通路中的核心成員之一,在調節(jié)巨噬細胞中活性氧的產生和細菌殺傷中起到重要的作用,核因子E2相關因子2(Nrf2)通過促進下游抗氧化基因及解毒酶基因表達,發(fā)揮抗氧化作用。Mst1-Nrf2通路參與細胞氧化應激和炎性反應等多種生物學反應。Nrf2基因激活后能夠抑制線粒體活性氧(ROS)和炎性因子的產生,Mst1缺乏可以減輕細胞氧化應激,但Mst-Nrf2通路在FSGS作用尚不十分明確[7-11]。鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種廣泛存在于多種軟果、堅果類植物中的一種天然多酚,國內外既往研究證明,EA具有清除自由基、抑制脂質過氧化等抗氧化、抗炎及激活自噬抑制癌細胞增殖等生物活性功能[11-14]。但EA作用的確切的分子機制尚不明確,EA是否可能通過Mst-Nrf2通路參與氧化應激和炎性反應而發(fā)揮腎臟保護作用尚未有研究證實。故本實驗通過構建阿霉素誘導的經典FSGS 大鼠模型,進而研究EA在阿霉素誘導的FSGS大鼠中是否存在調節(jié)氧化應激的腎臟保護作用及分析可能的分子機制,以期在臨床治療FSGS時提供新的治療思路。
1.1 實驗動物 購自長沙斯萊克景達實驗動物有限公司的SD雄性大鼠30只[合格證號:SCXK(湘)2019-0004],200~250 g,動物房常規(guī)環(huán)境,標準飼料飼養(yǎng),自由攝食及飲水。試劑:鞣花酸購買自美國Sigma 公司,阿霉素針劑購自于美國輝瑞制藥有限公司。
1.2 模型建立及實驗分組 將健康SD大鼠30只隨機編為對照組(6只)、模型組(12只)、實驗組(12只)3組。對照組大鼠尾靜脈一次按10 ml/kg注射0.9%氯化鈉溶液,模型組和實驗組大鼠尾靜脈一次按10 mg/kg劑量注射阿霉素(阿霉素1 mg/ml溶于0.9%氯化鈉溶液),實驗組再每日按200 mg/kg 的劑量注射鞣花酸,模型組每日注射同等量0.9%氯化鈉溶液,注射時間均持續(xù)6 周[15-17]。6周后處死所有組別大鼠,并收集腎臟、血液、尿液標本并按實驗常規(guī)要求保存。3組大鼠血尿標本復融離心后采用全自動生化儀檢測并分析血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白、可溶性尿激酶、24 h尿總蛋白及血膽固醇的結果。將各組大鼠腎組織取出勻漿離心取上清液后,采用硫代巴比妥酸法檢測各組大鼠腎組織丙二醛的含量,采用Sedlak和Lindsay的方法測定腎組織中還原型谷胱甘肽的含量,采用Lawrence和Burk的方法測定GSH過氧化物酶活性、采用Aebi的方法測定腎組織過氧化氫酶活性。
1.3 采用Western blot法檢測檢測腎組織纖維化相關指標表達 取腎臟皮質組織,快速放于液氮急凍,保存于-80℃冰箱中。取部分腎組織按照按Western blot標準實驗操作步驟操作,一抗二抗購置于美國Cell Signaling Technology 公司,抗體稀釋比例按照說明書建議操作。以β-actin 作為內參照,采用上海天能儀器機器自帶系統分析圖像。
1.4 采用實時熒光PCR(RT-PCR)檢測腎組織中Mst1-Nrf2通路蛋白mRNA的表達 腎組織用Trizol處理提取總RNA,并用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,并進行PCR擴增,再采用熒光定量PCR試劑盒在ABI 7300機器檢測,以GAPDH為內參,ΔΔct 法進行相對定量。每樣本至少重復3次獨立實驗。
1.5 采用PAS染色觀察腎組織腎小球硬化和間質纖維化情況 取腎組織按免疫組化福爾馬林固定、梯度酒精脫水并浸入石蠟等步驟后,使用石蠟切片機切片后染色觀察。免疫組化所使用的一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。
2.1 3組大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血膽固醇、可溶性尿激酶受體檢測結果 3組大鼠血清肌酐Scr、尿素氮、血清白蛋白、可溶性尿激酶受體、24 h尿蛋白定量。結果發(fā)現,模型組和相對于對照組的所檢測指標均有惡化加重(P<0.5)。而實驗組較模型組各項指標均有緩解。見表1。
表1 3組大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血膽固醇、可溶性尿激酶受體檢測結果
2.2 3組大鼠腎組織丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性比較 模型組大鼠腎組織丙二醛含量明顯高于對照組(P<0.01)。實驗組丙二醛水平較模型組明顯降低。對照組和模型組GSH水平無顯著性差異,而實驗組GSH水平高于其他各組。與對照組相比,模型組腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性顯著降低。而實驗組腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性降低程度小于模型組。見表2。
表2 3組大鼠腎組織丙二醛、還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性結果
2.3 采用RT-PCR檢測腎組織中Mst1和Nrf2的mRNA表達 相比對照組,模型組的Mst1的mRNA表達上調,Nrf2的mRNA表達下調。而實驗組較模型組Mst1的mRNA表達減少,而Nrf2的mRNA表達增加。見表3。
表3 RT-PCR檢測腎組織中Mst1和Nrf2的mRNA表達
2.4 采用Western Blot 和RT-PCR 檢測腎臟纖維化指標Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的表達來衡量腎小球硬化和間質纖維化發(fā)展情況 模型組較對照組各纖維化指標表達明顯上調,而實驗組纖維化指標的表達被不同程度抑制。故鞣花酸能有效逆轉阿霉素誘導的FSGS 大鼠腎組織纖維化進程。見表4,圖1。
表4 RT-PCR檢測Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的mRNA表達
圖1 鞣花酸對阿霉素誘導的FSGS大鼠腎臟纖維化指標的影響,Western Blot檢測Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β蛋白表達
2.5 PAS染色法可以用來檢測組織中的糖類使其呈現紫紅色 模型組的腎組織表現為明顯的腎小球硬化和間質纖維化,但當鞣花酸處理后的實驗組腎小球病理損傷明顯減輕。見圖2。
對照組模型組實驗組
腎小球疾病常因足細胞損傷而臨床表現為蛋白尿,可引起進行性腎小球硬化[1,2]。FSGS是一種常見的原發(fā)性腎小球病變,部分患者最終可進展為ESRD,對患者生存質量造成嚴重不良影響[4]。而FSGS發(fā)病機制還不明確,目前已有研究證明氧化應激和炎性反應在其病生理過程中發(fā)揮了重要作用[1],會對足細胞的組織結構及生理功能產生影響,引起進行性腎小球硬化[13]。已有研究證實Mst1-Nrf2通路參與細胞氧化應激和炎性反應[8,9]。
已有研究證實,FSGS有多種造模方法,比較常用和公認的采用尾靜脈注射阿霉素誘導造模,這是因為阿霉素的腎毒性較強,能誘導氧化應激反應、抑制腎小球足細胞周期,與人FSGS相近,臨床表現為腎病綜合征。在本研究中發(fā)現,鞣花酸在阿霉素誘導的FSGS大鼠通過抑制Mst1蛋白和促進Nrf2蛋白的產生,從而減弱腎組織的氧化應激和炎性反應,延緩FSGS 的病理進程,發(fā)揮腎臟保護作用。
鞣花酸為天然多酚,多項研究證明其具有抗氧化、抗炎等等多種生物活性。本研究結果證明在使用鞣花酸處理阿霉素誘導的FSGS大鼠模型后,大鼠的腎功
能、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量、血膽固醇水平、可溶性尿激酶受體、腎組織ROS等指標均得到改善,腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性降低,腎小球硬化和間質纖維化也在病理損傷上得到減輕,有助于維持機體的正常生理功能。結果證明鞣花酸能緩解阿霉素誘導的FSGS大鼠腎臟結構和功能病變情況,且其可能通過Mst1-Nrf2通路抑制炎性反應和氧化應激而發(fā)揮作用。
綜上,鞣花酸可以緩解阿霉素誘導的FSGS大鼠腎臟病變,在FSGS防治中具備潛在臨床運用價值,詳細的分子機制尚不完全明確,有待進一步研究。