miR-145-5p靶向調(diào)控MRGBP基因表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

胡超前

白內(nèi)障是一種晶狀體混濁的疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害或致盲[1]。白內(nèi)障約占所有致盲原因的42%[2]，是全球致盲的主要原因[3]。其中，年齡相關(guān)性白內(nèi)障是成年人最常見(jiàn)的白內(nèi)障類型，與視覺(jué)和認(rèn)知障礙以及抑郁癥有關(guān)[4]。晶狀體上皮細(xì)胞可分化為晶狀體纖維，在晶狀體的生物學(xué)功能中起著重要的作用。根據(jù)報(bào)道，除了先天性白內(nèi)障外，晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是所有類型白內(nèi)障的細(xì)胞基礎(chǔ)[5]，但晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。它們還參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物過(guò)程[6]。新的證據(jù)表明，miR-145-5p在各種疾病的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-9]。并且miR-145-5p的抑制可以提高高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖，和抑制細(xì)胞凋亡，miR-145-5p可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點(diǎn)[10]。MRG結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(MRG domain binding protein，MRGBP)在胰腺癌中高表達(dá)，其低表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。然而miR-145-5p在白內(nèi)障中的作用及其是否通過(guò)靶向MRGBP調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡目前尚未可知。因此，本研究構(gòu)建晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型，研究miR-145-5p在其中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并結(jié)合MRGBP對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SRA01/04細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)相關(guān)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，MRGBP抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3/C-caspase-3)購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其陰性對(duì)照、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自廣州銳博生物有限公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 SRA01/04細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育。觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入胰酶消化，并接種傳代。建立晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型時(shí)，參照秦宇等[12]用紫外線照射的方法進(jìn)行操作，即收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SRA01/04細(xì)胞，置于360 μW/cm2照射強(qiáng)度的紫外燈下照射25 min。照射完成后，細(xì)胞于37℃、5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-145-5p、MRGBP mRNA水平 在SRA01/04細(xì)胞中加入TRIzol試劑提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制成cDNA，以cDNA為模板，利用qPCR檢測(cè)試劑盒測(cè)定miR-145-5p、MRGBP mRNA表達(dá)。引物序列分別為miR-145-5p：5’-GTCCAGTTTTCCCAGG

AATC-3’(正向)，5’-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3’(反向)，MRGBP：5’-GGAGGAGACAGTGGTGTGG-3’(正向)，5’-CATGTGGAAGTGTCGGTTCA-3’(反向)，內(nèi)參U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反應(yīng)結(jié)束后，由2-ΔΔCt法計(jì)算miR-145-5p、MRGBP mRNA表達(dá)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)MRGBP蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取SRA01/04細(xì)胞中的蛋白，BCA法定量后進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，將膜與1∶1 000稀釋的MRGBP一抗4℃孵育過(guò)夜，次日使用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)充分漂洗膜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為參照，分析MRGBP蛋白條帶。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將5×105個(gè)/ml密度的SRA01/04細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，利用Lipofectamine 2000試劑，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其相應(yīng)陰性對(duì)照，并且依照1.2所述方法進(jìn)行紫外線照射，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，分別根據(jù)1.3和1.4中的方法檢測(cè)miR-145-5p和MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)。

1.6 噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整SRA01/04細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入20 μl MTT溶液，反應(yīng)4 h，之后加入150 μl二甲基亞砜，搖床震蕩反應(yīng)10 min，于酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞490 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)。細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SRA01/04細(xì)胞凋亡的檢測(cè)依照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的指示，在1×106個(gè)/ml密度的SRA01/04細(xì)胞中加入500 μl緩沖液，使細(xì)胞重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC、5μl PI染色液，分別混勻后于黑暗中反應(yīng)15 min，置流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與雙熒光素酶活性檢測(cè) starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)出miR-145-5p和MRGBP的3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有miR-145-5p結(jié)合位點(diǎn)的MRGBP-3’UTR野生型(WT)及突變型(MUT)報(bào)告基因載體，在SRA01/04細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-145-5p和MRGBP野生型及突變型報(bào)告基因載體，48 h檢測(cè)細(xì)胞雙熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-145-5p和MRGBP在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照比較，凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中miR-145-5p表達(dá)量明顯增加，MRGBP mRNA和MRGBP蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western blot檢測(cè)MRGBP蛋白表達(dá)

表1 miR-145-5p和MRGBP在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 低表達(dá)miR-145-5p對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對(duì)照比較，凋亡模型SRA01/04細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)量明顯增加，cyclinD1表達(dá)量、細(xì)胞增殖率顯著減少，C-caspase-3水平、細(xì)胞凋亡率明顯提高(P<0.05)。與凋亡模型+anti-miR-NC比較，低表達(dá)miR-145-5p顯著減少凋亡模型SRA01/04細(xì)胞的miR-145-5p表達(dá)量，明顯增加cyclinD1表達(dá)量、細(xì)胞增殖率，以及顯著降低C-caspase-3水平、細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 低表達(dá)miR-145-5p對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;B Western blot檢測(cè)cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)

表2 低表達(dá)miR-145-5p對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 高表達(dá)MRGBP對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與凋亡模型+pcDNA-NC比較，高表達(dá)MRGBP明顯增加凋亡模型SRA01/04細(xì)胞中MRGBP蛋白表達(dá)量、cyclinD1蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率，而顯著降低C-caspase-3蛋白水平、細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖3。

表3 高表達(dá)MRGBP對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖3 Western blot檢測(cè)MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)

2.4 miR-145-5p靶向調(diào)控MRGBP表達(dá) Starbase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p和MRGBP的3’UTR部分堿基存在互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。相比于miR-NC和WT(MRGBP)共轉(zhuǎn)染，miR-145-5p與WT(MRGBP)共轉(zhuǎn)染的SRA01/04細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性明顯降低(P<0.05)；miR-NC或miR-145-5p與MUT(MRGBP)共轉(zhuǎn)染后，SRA01/04細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著變化。與miR-NC比較，miR-145-5p組MRGBP蛋白表達(dá)量明顯減少；與anti-miR-NC比較，anti-miR-145-5p組MRGBP蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4、5，圖4。

表4 miR-NC或miR-145-5p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

表5 Western blot檢測(cè)MRGBP的表達(dá)

圖4 miR-145-5p靶向調(diào)控MRGBP表達(dá);A starbase對(duì)miR-145-5p和MRGBP結(jié)合的預(yù)測(cè)示意圖;B Western blot檢測(cè)MRGBP表達(dá)量

2.5 低表達(dá)MRGBP可以逆轉(zhuǎn)miR-145-5p低表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型增殖和凋亡的影響 與凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-NC比較，凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-MRGBP組SRA01/04細(xì)胞的MRGBP、cyclinD1蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率明顯減少，C-caspase-3蛋白水平、細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表6。

圖5 Western blot檢測(cè)MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)

表6 低表達(dá)MRGBP可以逆轉(zhuǎn)miR-145-5p低表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型增殖和凋亡的影響

3 討論

白內(nèi)障仍然是導(dǎo)致患者視力障礙和失明的主要原因。目前，手術(shù)干預(yù)是治療白內(nèi)障的有效方法。然而，人口特點(diǎn)和高昂的手術(shù)費(fèi)用給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。此外，患者也可能發(fā)生不可逆的手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥[13]。因此，為了預(yù)防或延緩白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展，仍需要新的治療策略。晶狀體上皮細(xì)胞在晶狀體整個(gè)生命周期中負(fù)責(zé)晶狀體纖維的分化。正確的晶狀體上皮細(xì)胞分化和形態(tài)維持晶狀體的正常透明，而晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等的病理變化可能導(dǎo)致白內(nèi)障[14,15]。本研究以晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04為對(duì)象，利用紫外線照射建立細(xì)胞凋亡模型，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照比較，凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中細(xì)胞增殖率、cyclinD1表達(dá)量顯著減少，細(xì)胞凋亡率、C-caspase-3水平明顯提高，與前人報(bào)道[16,17]相符。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA 3，UTR的互補(bǔ)序列結(jié)合，可以誘導(dǎo)其降解或翻譯抑制[18]。研究表明，一些miRNA與白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)，提示miRNA可能成為白內(nèi)障診斷和治療的新靶點(diǎn)[19,20]。Lu等[21]發(fā)現(xiàn)miR-24在年齡相關(guān)性白內(nèi)障和氧化應(yīng)激刺激的晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成的新機(jī)制。Chen等[22]報(bào)道了miR-26a和miR-26b可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移和晶狀體的體內(nèi)外纖維化。根據(jù)報(bào)道，miR-145-5p被認(rèn)為具有抑癌作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制體內(nèi)外腫瘤發(fā)生[23-25]。此外，miR-145-5p參與一些眼科疾病進(jìn)展，在小鼠視網(wǎng)膜組織中，miR-145-5p表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)下調(diào)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的表達(dá)影響眼軸的增長(zhǎng)[26]。然而，miR-145-5p在白內(nèi)障中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p的生物學(xué)功能和分子機(jī)制與白內(nèi)障的進(jìn)展相關(guān)。與對(duì)照比較，凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中miR-145-5p表達(dá)明顯上調(diào)，低表達(dá)miR-145-5p顯著增加凋亡模型SRA01/04細(xì)胞的增殖率、cyclinD1表達(dá)量，顯著降低細(xì)胞凋亡率、C-caspase-3水平。說(shuō)明miR-145-5p影響白內(nèi)障的進(jìn)展，下調(diào)miR-145-5p在凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞中表現(xiàn)出促進(jìn)增殖和抑制凋亡的功能，與Zhang等[10]的研究相似。

本實(shí)驗(yàn)中，凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中MRGBP mRNA、MRGBP蛋白表達(dá)量顯著減少，提示MRGBP可能在晶狀體上皮細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MRGBP也稱為20號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框20，是編碼包含組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)錄域相關(guān)蛋白(TRRAP)/tat相互作用蛋白60(TIP60)的一個(gè)亞基[27]。MRGBP已被證明在肺腫瘤組織中異常升高[28]，通過(guò)發(fā)揮其在細(xì)胞增殖和(或)癌細(xì)胞分裂方面的優(yōu)勢(shì)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[27]。然而MRGBP對(duì)白內(nèi)障的影響尚不清楚。本研究的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)MRGBP顯著增加凋亡模型SRA01/04細(xì)胞的增殖率、cyclinD1表達(dá)量，明顯降低細(xì)胞凋亡率、C-caspase-3水平。表明MRGBP對(duì)凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)用于預(yù)測(cè)miR-145-5p在MRGBP 3，UTR中的可能結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，miR-145-5p可直接靶向MRGBP的3，UTR并降低其表達(dá)。同時(shí)，低表達(dá)MRGBP可以逆轉(zhuǎn)miR-145-5p低表達(dá)促進(jìn)凋亡模型中SRA01/04細(xì)胞增殖、cyclinD1蛋白表達(dá)的作用，以及逆轉(zhuǎn)了其抑制細(xì)胞凋亡、C-caspase-3蛋白表達(dá)的作用。這些結(jié)果證實(shí)，miR-145-5p對(duì)凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和凋亡的影響可能是通過(guò)靶向調(diào)控MRGBP的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-145-5p在凋亡模型晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，低表達(dá)miR-145-5p能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，和抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控MRGBP的表達(dá)有關(guān)，為白內(nèi)障的臨床診治提供了新的見(jiàn)解。