妊娠期糖尿病孕婦血清中血管細胞黏附分子-1 miR-21-3p miR-155-5p及內(nèi)臟脂肪素水平的變化及其臨床意義

段艷芳 劉風(fēng)偉 秦業(yè)強 趙金梅 姚曉玲 何文慧

全球妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM) 發(fā)病率高達16.39%，給母嬰安全造成嚴重威脅，因此早篩具有重要意義。研究表明，血管內(nèi)皮功能損傷、脂代謝紊亂與GDM發(fā)生密切相關(guān)。血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)是一種細胞膜表面糖蛋白，可介導(dǎo)細胞黏附和信號傳遞，在血管內(nèi)皮功能損傷中扮演重要角色。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是一種脂肪細胞因子，可促進脂肪組織聚集、合成、分化，引起脂肪過度蓄積，導(dǎo)致脂代謝紊亂。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，多種微小RNA(microRNAs，miRNAs)參與滋養(yǎng)層細胞生長、遷移、血管生成等胎盤發(fā)育過程，可影響胎盤葡萄糖吸收，增加母體血糖水平。Wander等研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者存在多種miRNAs表達異常，其中又以miR-155-5p和miR-21-3p異常表達最明顯，但未分析其與GDM的關(guān)系。本研究觀察了GDM患者血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平變化，探討其與GDM的關(guān)系，以期為防治GDM提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取滄州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2019年1月至2020年1月收治的58例GDM患者為GDM組，經(jīng)糖耐量試驗確診，年齡24～38歲，平均(30.54±4.65)歲；孕周32～40周，平均(36.32±3.08)周。另選取60健康孕婦為對照組，年齡23～39歲，平均(29.36±5.28)歲；孕周33～40周，平均(36.43±3.20)周。兩組孕婦年齡和孕周對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)。納入標準：①GDM符合美國糖尿病學(xué)會《妊娠期糖尿病診治指南(2019)》中診斷標準；②患者及家屬均知情研究；③臨床資料完整者；④無其他產(chǎn)科并發(fā)癥者；⑤近期未接受降糖治療者；⑥單胎初產(chǎn)者。排除標準：①自身免疫性疾病者；②急性炎癥期者；③惡性腫瘤者；④繼發(fā)性糖尿病者；⑤重要器官功能損傷者。本研究經(jīng)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集兩組孕婦一般資料，包括年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙、孕周等，并抽取5 mL空腹肘靜脈血，邁瑞B(yǎng)S-450全自動生化分析儀測定三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、糖化血紅蛋白(hemoglobin a1c，HbA1c) 水平。放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平，HOMA穩(wěn)態(tài)模型法評價胰島素抵抗(insulin resistance，IR)程度，HOMA-IR指數(shù)=FING×FPG/22.5。

1.2.2 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p、Visfatin水平測定 采集GDM組入院后24小時、對照組體檢當(dāng)日空腹肘靜脈血，酶聯(lián)免疫吸附法(上海古朵生物科技有限公司，貨號：GD-S0116-B、GD-hj0981)測定VCAM-1、Visfatin水平。①標準品加樣：分別設(shè)置1個樣品孔和6個標準孔，各標準孔依次加入標準品。②加樣：設(shè)置空白孔，不加樣品和酶標試劑；設(shè)置待測樣品孔，加入樣品稀釋液和待測樣品，使樣品最終稀釋度為5倍。③加酶：除空白孔外，各孔加酶標記試劑。④溫育：封板膜封板，置于37 ℃溫箱中孵育1 h。⑤配液：20倍濃縮洗滌液蒸餾水稀釋20倍。⑥洗滌：去除封板膜，甩干液體，各孔加滿配液，靜置30 s棄除，重復(fù)操作5次后拍干。⑦顯色：各孔加入顯色劑A、B，混勻，避光下顯色15 min。⑧終止：各孔加入終止液。⑨測定：以空白孔歸零，依次于波長450 nm下測量各孔光密度值。⑩濃度計算：以標準物濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線，找到對應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品實際濃度。qPCR檢測血清miR-21-3p、miR-155-5p水平：總RNA提取試劑盒(錸博生化科技有限公司)提取血清總RNA，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物miR-21-3p(正向引物：5’-ATCGTAGCTACTAGTACGTG-3’，反向引物：5’-GCATGCTCATGAGCATCG-3’)、miR-155-5p(正向引物：5’-GCTGTATGCATGAGAGTCAG 3’，反向引物：5’-AGCATGCTAGTACGTACG-3’)，反應(yīng)體系20 μL，擴增條件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s，循環(huán)45次，以U6作內(nèi)參校正，2法計算血清miR-21-3p、miR-155-5p相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦一般資料和實驗室指標對比 GDM組FPG、HOMA-IR、HbA1c、TG、TC、LDL-C、VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p、Visfatin水平均高于對照組，HDL-C低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)。見表1。

表1 兩組孕婦一般資料和實驗室指標對比

2.2 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平與臨床指標的相關(guān)性 Pearson相關(guān)系數(shù)顯示，血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平與BMI、FPG、HOMA-IR、HbA1c、TG、TC、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負相關(guān)(

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<0.05)。見表2。

表2 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平與臨床指標的相關(guān)性

2.3 多因素logistics回歸分析 以單因素分析中差異顯著的指標為自變量，以是否為GDM為因變量(賦值：是=1，否=0)，多因素logistics回歸分析顯示，高FPG、HOMA-IR、VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p、Visfatin水平為GDM發(fā)病的獨立危險因素(

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<0.05)。見表3。

表3 多因素logistics回歸分析

2.4 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平對GDM的診斷價值 以血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平為檢驗變量，GDM為狀態(tài)變量，ROC曲線顯示，血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin診斷GDM的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.877、0.798、0.800、0.842，敏感度為73.33%、73.93%、78.57%、82.57%，特異度為82.81%、66.65%、68.03%、77.12%。見表4、圖1。

圖1 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin診斷GDM的ROC曲線

表4 血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin對GDM的診斷價值

3 討論

GDM為危害孕婦和圍生兒生命健康常見的妊娠期合并癥，可紊亂孕婦代謝功能，引起孕婦酮癥酸中毒、新生兒高膽紅素血癥、新生兒低鈣血癥、新生兒低血糖、死產(chǎn)、羊水過多、巨大兒、胎兒窘迫、胎兒畸形、自然流產(chǎn)等多種嚴重情況。目前尚不明確其發(fā)病機制，主要通過孕中期血糖水平診斷GDM，尚缺乏可早期預(yù)測GDM的血清生物標志物，雖然部分孕婦產(chǎn)后可恢復(fù)正常，但仍有較大概率引起持續(xù)危害，故尋找GDM發(fā)病相關(guān)因子，對臨床診斷和及早干預(yù)具有重要意義。

血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)為胰島素功能發(fā)揮靶器官，當(dāng)VEC受損時則會給其表面胰島素受體結(jié)構(gòu)和功能造成影響，影響胰島素與受體結(jié)合，同時VEC受損還會影響胰島素敏感組織的血流狀態(tài)，進而影響靶組織的轉(zhuǎn)運功能，最終降低胰島素敏感性，并導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance,IR)。VCAM-1為免疫球蛋白超家族成員，廣泛分布于B淋巴細胞、胎盤滋養(yǎng)層細胞、VEC等細胞表面，在免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)、血栓形成、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、維護正常組織穩(wěn)定中扮演重要角色，并參與VEC遷移及血管形成等過程。Siddiqui等研究顯示，VCAM-1為VEC激活的敏感指標，隨著VEC的激活，可表達黏附分子，引起白細胞聚集，并遷移至炎癥部位，引導(dǎo)其進入內(nèi)膜，損傷VEC，導(dǎo)致IR，最終引起GDM。本研究結(jié)果顯示，GDM組血清VCAM-1水平明顯高于對照組，提示血清VCAM-1水平與GDM有關(guān)。進一步分析顯示，血清VCAM-1水平與BMI、FPG、HOMA-IR、HbA1c、TG、TC、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負相關(guān)，為GDM發(fā)病的獨立危險因素(

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<0.05)，說明VCAM-1與GDM發(fā)生有密切關(guān)系，隨其水平的提升，GDM發(fā)病風(fēng)險增加。隨著VCAM-1水平的提升，可進一步損傷VEC功能，引起GDM，同時高水平VCAM-1還會損傷胎盤滋養(yǎng)層細胞和VEC功能，影響胎盤功能，引起低血糖兒、巨大兒、胎膜早破、胎兒窘迫等不良妊娠結(jié)局。miRNAs是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源非編碼小RNA，長度僅20 bq左右，可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄參與胎盤的血管生成、細胞分化及生長發(fā)育等過程，檢測血液循環(huán)中miRNAs能預(yù)測β細胞功能障礙和GDM發(fā)生。Muralimanoharan等研究顯示，GDM孕婦胎盤中miR-143表達明顯降低，可通過調(diào)節(jié)胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運體1、糖酵解酶、泌乳素等影響有氧糖酵解代謝和線粒體功能。Li等研究顯示，GDM孕婦胎盤中miR-33a和miR-137等miRNAs表達明顯降低，miR-508-3p表達明顯提升，可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體/磷脂酰肌醇3-激酶信號通路參與GDM發(fā)生。上述研究均表明，多種miRNAs于GDM孕婦胎盤組織存在異常表達，但胎盤組織僅能在分娩后取得，因此不能作為早期預(yù)測的有效方法。隨著分子研究的進展，循環(huán)系統(tǒng)中核苷酸等小分子越發(fā)受到關(guān)注。Mazzeo等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清miR-21-3p表達明顯提升，能反映糖尿病性視網(wǎng)膜病變。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清miR-155-5p表達明顯提升，能反映疾病嚴重程度。本研究結(jié)果顯示，GDM組血清miR-21-3p、miR-155-5p水平明顯高于對照組，與Wander等研究一致，提示血清miR-21-3p、miR-155-5p水平提升與GDM有關(guān)。進一步分析顯示，血清miR-21-3p、miR-155-5p水平與BMI、FPG、HOMA-IR、HbA1c、TG、TC、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負相關(guān)，且為GDM發(fā)病獨立危險因素(

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<0.05)，說明miR-21-3p、miR-155-5p與GDM發(fā)生有密切關(guān)系，隨著血清miR-21-3p、miR-155-5p水平提升，GDM風(fēng)險增加，但關(guān)于其病理機制還有待進一步研究。孕期體質(zhì)量增加為正常生理現(xiàn)象，有利于母體饑餓或空腹?fàn)顟B(tài)下動用脂肪以維持胎兒生長發(fā)育，但體質(zhì)量過度增加或肥胖，則會紊亂脂代謝，影響TG降解，增加極低密度脂蛋白合成，提升TG、TC、LDL水平，降低HDL水平，隨著脂代謝紊亂加重，脂肪細胞INS受體數(shù)降低，降低糖耐量，導(dǎo)致IR。GDM與肥胖存在血液高凝、葡萄糖耐量異常、脂肪代謝障礙等共同的病理生理特征，故脂肪組織內(nèi)分泌功能愈發(fā)受到關(guān)注。Visfatin是一種肽類激素，主要由內(nèi)臟脂肪組織分泌，其水平高低與內(nèi)臟脂肪數(shù)量有關(guān)，可使血漿葡萄糖轉(zhuǎn)化為TG，堆積于前脂肪細胞，促進脂肪組織聚集、合成、分化，大量脂肪沉積內(nèi)臟脂肪組織則會增加體質(zhì)量，引起肥胖。劉俊秀等研究顯示，血清Visfatin水平可隨著妊娠的進展而提升，在妊娠中晚期達高峰，并與孕婦IR存在明顯相關(guān)，提示血清Visfatin水平上升可能是妊娠期IR的一種代償作用。Yin等研究顯示，GDM孕婦血清Visfatin水平明顯提升，產(chǎn)后血糖恢復(fù)正常后，Visfatin水平也明顯降低。本研究結(jié)果顯示，GDM組血清Visfatin水平明顯高于對照組，與上述研究一致，提示血清Visfatin水平提升與GDM有關(guān)。進一步分析顯示，血清Visfatin水平與BMI、FPG、HOMA-IR、HbA1c、TG、TC、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負相關(guān)，為GDM發(fā)病的獨立危險因素(

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<0.05)，說明Visfatin與GDM發(fā)生有密切關(guān)系，隨著其水平提升，GDM發(fā)病風(fēng)險增加?？赡芘c高水平Visfatin可強化L6肌細胞和3T3-L1脂肪細胞對血漿葡萄糖的攝取，抑制肝細胞釋放葡萄糖，減少胰島素釋放，增加GDM風(fēng)險有關(guān)。本研究ROC曲線顯示，血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin診斷GDM的AUC為0.877、0.798、0.800、0.842，敏感度為73.33%、73.93%、78.57%、82.57%，特異度為82.81%、66.65%、68.03%、77.12%，說明4個指標均能作為GDM診斷生物學(xué)標志物。

綜上所述，GDM孕婦血清VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin水平明顯提升，為GDM獨立危險因素，可作為GDM診斷的生物學(xué)標志物。但GDM發(fā)病機制復(fù)雜，且本研究納入病例數(shù)較少，沒有完全解釋VCAM-1、miR-21-3p、miR-155-5p及Visfatin在其中的病理機制，特別是miR-21-3p和miR-155-5p，因此后續(xù)還需擴大樣本量，進一步研究闡明其具體分子機制，指導(dǎo)臨床早期干預(yù)。