3種新疆產(chǎn)藥材的降血糖作用研究

游鳳，孟晉武，肖迪，王金麗，王穎，劉家國(guó)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/教育部“動(dòng)物健康與食品安全”國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見的慢性代謝性疾病，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生胰島素不足或者發(fā)生對(duì)胰島素的反應(yīng)缺失時(shí)，會(huì)造成碳水化合物的代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致血液和尿液中的葡萄糖水平升高，并引起一系列的并發(fā)癥。近年來(lái)，隨著人們生活的逐步城市化，以及寵物飼養(yǎng)管理不當(dāng)，糖尿病在人和寵物中的患病率均呈逐年快速上升的趨勢(shì)。有調(diào)查表明，糖尿病犬貓的平均中位存活期僅為964 d(32個(gè)月)[1]。

目前廣泛使用的降糖西藥及胰島素均有不同程度的副作用[2-3]。因此，需要開發(fā)降糖效果優(yōu)良且副作用小的降糖藥物，中藥具有很大的潛力。香茅草、芡實(shí)、睡蓮花3種新疆產(chǎn)藥材資源豐富，分布廣泛，且具有歸經(jīng)明確、以及良好的全身性調(diào)整作用[4-6]，對(duì)內(nèi)分泌紊亂的糾正有獨(dú)特效果，且副作用小。以往主要在清熱解毒、抗菌抗病毒、增強(qiáng)免疫等方面應(yīng)用與研究，關(guān)于其降糖作用的報(bào)道較少。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是輔助哺乳動(dòng)物體內(nèi)碳水化合物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，在餐后血糖的升高中起著關(guān)鍵作用[7]。因此，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制劑可通過(guò)各種機(jī)制減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。正常小鼠快速高血糖模型是一種使血糖快速升高的簡(jiǎn)單靈敏且可操作性強(qiáng)的體內(nèi)模型，相比于體外降糖試驗(yàn)，該試驗(yàn)使得藥物在體內(nèi)會(huì)經(jīng)歷真正的代謝，所得數(shù)據(jù)更加具有說(shuō)服力，與真正的糖尿病大鼠模型相比，更加節(jié)省時(shí)間，且難度降低，是良好的篩選降糖藥物的研究模型[8]。本試驗(yàn)主要通過(guò)研究3種新疆產(chǎn)藥材提取物對(duì)2種酶的抑制率，來(lái)探究3種藥物提取物的體外降糖作用，并且通過(guò)研究對(duì)快速高血糖小鼠模型的影響來(lái)探究其在體內(nèi)的降糖作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體重(18～20 g)共25只，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：201920941，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0001。

1.2 受試藥物及準(zhǔn)備

香茅草、睡蓮花由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，芡實(shí)購(gòu)自江蘇天晟醫(yī)學(xué)科技有限公司，產(chǎn)地為新疆。

香茅草：室溫下，稱取香茅草20 g，按料液比1∶20加入400 mL蒸餾水，煮沸，維持沸騰40 min，重復(fù)2次，置完全冷卻，3層濾紙過(guò)濾，取煎液，然后加入到真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

睡蓮花：室溫下，稱取睡蓮干花20 g，按料液比1∶20加入400 mL(淹沒過(guò)藥末表面)70%的乙醇超聲波萃取，超聲溫度56 ℃，超聲時(shí)間40 min，重復(fù)兩次。3層濾紙抽濾。然后加入到真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

芡實(shí)：室溫下，取一定量的芡實(shí)，進(jìn)行粉碎之后取芡實(shí)粉末20 g，按料液比1∶15加入300 mL 70%的乙醇，放置在90 ℃水浴鍋中水浴4 h，3層濾紙抽濾，然后加入到真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

1.3 試劑

3, 5二硝基水楊酸/DNS(20180427)購(gòu)自廣東光華科技有限公司；可溶性淀粉(1711092)購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；酒石酸鉀鈉(20180712)購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司；α-淀粉酶(L28O8D46151)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(R06D8Y50059)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷/pNPG(K22J9B64113)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍腸溶片(181103)，購(gòu)自北京京豐制藥有限公司，用去離子水每天現(xiàn)配現(xiàn)用；50%葡萄糖溶液(E18120305)，購(gòu)自湖南科倫制藥有限公司。

1.4 方法

1.4.1 3種新疆產(chǎn)藥材的體外降糖作用比較

參照葉瓊仙等[9]和蘇堯堯[10]的方法，并稍作改進(jìn)。

對(duì)ɑ-淀粉酶活性的抑制能力的檢測(cè)：將500 μL的待測(cè)樣品與500 μL 1 U/mL的α-淀粉酶溶液加入試管中，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，加入1%的淀粉溶液1 mL，繼續(xù)37 ℃水浴反應(yīng)15 min，水浴反應(yīng)結(jié)束后，立即加入1 mL DNS顯色劑，并且沸水浴5 min后冷卻至室溫。按照1∶20的比例加入蒸餾水進(jìn)行稀釋混勻，于540 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示α-淀粉酶溶液+樣品+淀粉溶液+DNS顯色劑；A背景表示樣品+淀粉溶液+DNS顯色劑；A空白表示α-淀粉酶溶液+淀粉溶液+DNS顯色劑。

對(duì)ɑ-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的檢測(cè)：在96孔板中加pH值5.0的磷酸鹽緩沖溶液40 μL，加入樣品溶液40 μL，再加入7 000 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混勻，在37 ℃下反應(yīng)30 min，而后加入2.5 mmol/L的pNPG溶液40 μL，繼續(xù)在37 ℃反應(yīng)30 min，最后加入100 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。于405 nm波長(zhǎng)(測(cè)的是PNP)處測(cè)定吸光值。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示緩沖溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+樣品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A背景表示緩沖溶液+樣品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A空白表示緩沖溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性抑制試驗(yàn)均以阿卡波糖(α-葡萄糖苷酶抑制劑)作為陽(yáng)性對(duì)照(阿卡波糖+酶液+底物)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 3種新疆產(chǎn)藥材對(duì)腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影響比較

所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為5組：芡實(shí)提取物組(EUR)、香茅草提取組(CYM)、睡蓮花提取組(NYM)、二甲雙胍(陽(yáng)性對(duì)照)組(MET)和模型組(Model)。芡實(shí)各組每早9:00準(zhǔn)時(shí)以相應(yīng)受試物懸液10 g/kg灌胃，陽(yáng)性藥對(duì)照組給予二甲雙胍75 mg/kg，模型組灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為0.2 mL/20 g，連續(xù)灌胃2周。最后一次給藥后，各組小鼠禁食(不禁水)6 h，先測(cè)量空腹血糖，再分別灌胃給受試藥物，給藥30 min后，各組小鼠腹腔一次性注射50%葡萄糖溶液0.1 mL/20 g，尾尖采血，用血糖儀測(cè)定葡萄糖注射后15、30、45、60、90和120 min時(shí)間點(diǎn)的血糖值。血糖值結(jié)果用mmol/L表示。采用GraphPad Prism 5.01軟件計(jì)算曲線下面積(area under the cure，AUC)，比較各組的葡萄糖耐量水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行，各組數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間差異的顯著性采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1、圖2可知，阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)隨著阿卡波糖濃度的增大，抑制率增加逐漸變緩，即曲線斜率變小的情況，直接用直線對(duì)其擬合所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式R2較大，采用自然對(duì)數(shù)公式y(tǒng)=aLn(x)+b進(jìn)行擬合，基本符合曲線走向。

圖1 阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制曲線

圖2 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制曲線

2.2 各受試藥物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

香茅草提取物和芡實(shí)提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制能力與藥物濃度呈正相關(guān)，在2 g生藥/mL時(shí)，二者對(duì)淀粉酶的抑制能力最佳，對(duì)α-淀粉酶的抑制率分別達(dá)88.3%和79.8%，睡蓮花提取物在試驗(yàn)中并未表現(xiàn)出對(duì)α-淀粉酶有抑制作用。見表1。

表1 各受試藥物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

2.3 各受試藥物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由表2可知，香茅草提取物和睡蓮花提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力與藥物濃度呈正相關(guān)，睡蓮花提取物的抑制能力更佳，在1 g生藥/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率就達(dá)76.0%，而芡實(shí)提取物在試驗(yàn)中并未表現(xiàn)出對(duì)α-淀粉酶有抑制作用，香茅草提取物的抑制能力也較差。

2.4 3種新疆產(chǎn)藥材對(duì)腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影響

由表3可知，各組的基礎(chǔ)血糖值睡蓮花提取物組最低，芡實(shí)提取物組最高，在腹腔注射葡萄糖15 min后，各組的血糖值均有顯著提升，并達(dá)到峰值，其中芡實(shí)提取物組的峰值最高，睡蓮花提取物組、香茅草提取物組和二甲雙胍組的峰值均低于模型組，其中睡蓮花組最低，較模型組低10.29%。自30 min開始，各組血糖值開始不同程度的下降，睡蓮花提取物組的下降速度僅次于二甲雙胍組，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值均低于模型組；比較血糖曲線下面積AUC可以發(fā)現(xiàn)，睡蓮花提取物組AUC與二甲雙胍組相近，均低于模型組，與香茅草提取和睡蓮花提取物均有顯著差異。而芡實(shí)提取物和香茅草提取物組的血糖調(diào)節(jié)能力較差。

表2 各受試藥物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

表3 3種新疆產(chǎn)藥材對(duì)腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的血糖值影響 mmol/L

3 討論

作為一種需要終身治療的慢性內(nèi)分泌疾病，糖尿病給患寵本身和寵物主人均帶來(lái)了很大的困擾。防治糖尿病，開發(fā)效果優(yōu)良、副作用更小的降糖藥已成為研究熱點(diǎn)。

由于傳統(tǒng)降糖藥物，如二甲雙胍類、格列本脲類雖然具有良好的降糖效果，但是其療效仍然十分有限，不僅無(wú)法阻止胰腺進(jìn)一步壞死，也無(wú)法刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的胰島素，而且會(huì)引起消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多系統(tǒng)損傷，尤其是肝腎損傷，其嚴(yán)重的胃腸道副作用也使患病動(dòng)物的生活質(zhì)量得不到保障。因此，近年來(lái)，尋找降糖效果好，且對(duì)機(jī)體副作用小的新型天然植物降血糖藥物逐漸成為研究熱點(diǎn)。

香茅草性味溫、辛，功效眾多，具有祛風(fēng)通絡(luò)、和胃通氣、溫中止痛、止瀉、醒腦催情的功效。以往對(duì)香茅草的研究主要集中揮發(fā)油，但香茅草的水提液和醇提液中含有黃酮、多糖等7種成分，植物多糖是近年來(lái)抗糖尿病的熱門成分，其能激活過(guò)氧化體增殖物激活型受體(PPAR)活性進(jìn)而激活體內(nèi)細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。王琦等[11]測(cè)量超聲提取的香茅草多糖含量為6.49%。此外，也有報(bào)道香茅草的根和葉有胰島素樣物質(zhì)[12]。因此，香茅草可能具有一定的降糖潛力。芡實(shí)在中醫(yī)上歸于腎經(jīng)和脾經(jīng)，有健脾利濕益腎、祛濕止帶的作用，芡實(shí)味甘，常與其他藥食同源的中藥飲片一同食用，可起到不同的功效；有中醫(yī)工作者將芡實(shí)作為一種輔助食物添入糖尿病患者的主食中，作為早晚餐使用，降糖效果顯著[13]；也有研究發(fā)現(xiàn)芡實(shí)殼三萜類提取物能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂，并改善胰島素抵抗?fàn)顩r[14]。關(guān)于芡實(shí)總醇提物的降糖效果，目前也未見報(bào)道。

在本次試驗(yàn)中，香茅草提取物和芡實(shí)提取物均對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)出較好的抑制能力，在2 g生藥/mL時(shí)，其抑制率分別達(dá)88.3%和79.8%，表明其具有良好的體外降糖活性，但是其對(duì)腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型表現(xiàn)出來(lái)的降糖效果并不理想。

睡蓮花味辛辣、苦甜，其具有清熱解毒的功效，其成分多樣。近年來(lái)對(duì)睡蓮花的降血糖作用的研究有所增加，發(fā)現(xiàn)具有明顯的腸內(nèi)葡萄糖苷酶抑制作用[15]。Rajagopal等[16]對(duì)睡蓮花醇提物對(duì)正常大鼠和四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，但機(jī)制不明；趙軍[17]研究了睡蓮花的有效成分，在有效成分對(duì)二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的高通量篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，睡蓮花提取物確實(shí)具有一定的降血糖作用，并可能與睡蓮花多酚含量較高有關(guān)。

在本次試驗(yàn)中，睡蓮花提取物僅對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出了抑制作用，對(duì)α-淀粉酶活性未表現(xiàn)出抑制作用。景贊等[18]已經(jīng)證實(shí)了藍(lán)睡蓮花的多酚類提取物對(duì)大鼠小腸麥芽糖酶與α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，但是對(duì)豬胰α-淀粉酶和大鼠蔗糖酶的活性沒有明顯影響，與本次試驗(yàn)結(jié)果基本相符。睡蓮花提取物組的AUC僅次于二甲雙胍組，雖然與模型組之間沒有顯著差異，其基礎(chǔ)血糖值與注射后15 min峰值都是所有組里面最低的，在30 ～120 min期間的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)里，睡蓮花提取物組的血糖值也是要低于其他組的，基礎(chǔ)血糖值發(fā)生變化這說(shuō)明睡蓮花提取物組提前2周的藥物調(diào)理對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了某些影響，而其峰值的降低以及快速的下調(diào)體內(nèi)高血糖則說(shuō)明其機(jī)體對(duì)血糖的吸收有所抑制，同時(shí)血糖調(diào)節(jié)能力也得到了一定的優(yōu)化，雖然尚不清楚其具體降糖機(jī)制，但是結(jié)合其良好的體外降糖作用，可以推測(cè)睡蓮花提取物具有較好的降糖潛力。