肢體內(nèi)外翻畸形肉雞腿部骨骼礦物元素含量變化及組織學分析

唐賀賀,郭亞蘋,張真真,李轉(zhuǎn)見,田亞東,康相濤,韓瑞麗

(河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南 鄭州 450002)

隨著對肉雞生產(chǎn)性能的高強度選育，肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)效率得到極大提高，但雞群中骨生長發(fā)育異常和腿病問題也日益突出，給肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。肢體內(nèi)外翻畸形(valgus-varus deformity，VVD)是肉雞常見的長骨畸形病。長骨畸形是指與正常骨相比長骨在結(jié)構(gòu)或形狀上發(fā)生扭曲。VVD雞遠端脛跗骨會發(fā)生一定角度的外翻或內(nèi)翻，即表現(xiàn)為跗關(guān)節(jié)內(nèi)弧或者外撇[2-4]。發(fā)病后肉雞不能正常站立和行走，嚴重影響采食和動物福利。眾多肉雞品系中，哈伯德肉雞生長速度快，出肉率高，生產(chǎn)中該品種腿病發(fā)生率也相對較高。我們前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，哈巴德肉雞VVD腿病以單側(cè)外翻為主，患VVD腿病雞的生長性能明顯下降，血鈣含量、血磷含量都發(fā)生異常改變，堿性磷酸酶的活性受到抑制，骨骼質(zhì)量降低[5-6]。

礦物元素是骨骼中重要的營養(yǎng)成分，在骨形成和骨吸收過程中發(fā)揮著重要作用，鈣、磷與灰分是作為評價骨骼性能的重要指標，與骨密度、骨強度等密切相關(guān)。鈣磷代謝受多種因素影響，任何造成鈣磷代謝障礙的因素均會引起不同程度的骨骼疾病[7-9]。此外，微量礦物元素對于動物的正常生長發(fā)育也至關(guān)重要。銅、錳、鋅是在動物機體內(nèi)含量較低的必需微量元素。銅元素是眾多抗氧化酶的組成成分，當機體內(nèi)缺銅時，抗氧化酶活性降低，影響破骨細胞的活化和增殖，降低骨骼強度[10-11]；錳缺乏能夠引起滑腱癥和脛骨短粗[12]；如果家禽缺鋅，則會導致骨骼礦化[13]。骨生長發(fā)育異?？赡軙墙M織形態(tài)學造成不良影響。骨形成是骨原細胞在骨生長發(fā)育期或骨組織修復過程中增殖分化為成骨細胞，進而成熟為骨細胞存在于骨組織內(nèi)[14]。在這一過程中，成骨細胞和破骨細胞起著關(guān)鍵作用，它們在多種細胞因子的調(diào)控下，協(xié)同維持骨的代謝平衡。同時，骨小梁對骨的支撐和維持血液等物質(zhì)轉(zhuǎn)運也起著重要作用。故本試驗通過對肉雞脛骨中鈣、磷、灰分、銅、錳、鋅元素的含量測定和腿部骨骼切片組織學分析，探究VVD與肉雞腿部骨骼中礦物元素含量的關(guān)系及病理組織學變化情況，旨在為我國肉雞生產(chǎn)和VVD腿病的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為哈巴德肉雞，取自遼寧省某養(yǎng)殖公司。

1.2 飼養(yǎng)管理條件

試驗肉雞為籠養(yǎng)方式，7日齡時進行分籠，分籠之前的飼養(yǎng)密度為35只/籠，分籠之后的飼養(yǎng)密度為12只/籠。在1～18日齡，飼喂含1.0% 鈣、0.45% 磷、12 331 MJ/kg代謝能和21.5%粗蛋白的統(tǒng)一日糧；19～40日齡，飼喂含0.85% 鈣、0.38% 磷、12 958 MJ/kg代謝能和20.0%粗蛋白的統(tǒng)一日糧。肉雞1日齡注射新城疫疫苗、支原體疫苗和傳染性法氏囊病病毒疫苗，7日齡飲水免疫新城疫疫苗，21日齡注射新城疫疫苗。所有肉雞飼養(yǎng)管理方法一致，自由采食和飲水。

1.3 檢測項目與方法

1.3.1 樣品采集

試驗肉雞頸靜脈放血處死后仰臥位保定，沿腹股溝剪開皮膚和肌肉，找到股骨頭所在位置，用手術(shù)刀小心將雞腿部分離，剝離腿部肌肉等附著組織，取股骨、脛骨、跖骨樣本，-20 ℃低溫保存。

1.3.2 灰分及鈣、磷含量的測定

28、38日齡時，分別選取6只VVD腿病雞和4只健康雞，對其脛骨進行鈣、磷及灰分測定?；曳譁y定時，先用生理鹽水將脛骨內(nèi)容物充分洗滌，之后用研缽進行充分研磨，隨后轉(zhuǎn)移到坩堝中，放入105 ℃烘箱干燥至恒重，最后經(jīng)電爐碳化至無煙，放到茂福爐中550 ℃灰化，稱重，計算脛骨灰分含量。鈣、磷測定時，首先將脛骨試樣采用干法消化，之后用雙蒸水定容至100 mL，采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)絡(luò)合滴定法測定脛骨鈣含量；采用分光光度計法測定脛骨磷含量。測定鈣、磷含量時每個樣品進行3次重復，取平均值。

1.3.3 銅、錳、鋅含量的測定

銅、錳、鋅的測定在河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司完成，測定方法為電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。

1.3.4 組織學檢查

甲苯胺藍染色，組織學分析。切片由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司制作。切片具體制作步驟如下：選取38日齡VVD腿病雞6只，健康雞4只，采集股骨、脛骨、跖骨，保存在4%的多聚甲醛中，固定液固定24 h以上；將標本浸入脫鈣液，放入微波爐10 min，溫度不超過40 ℃為宜，之后取出樣本，更換脫鈣液，置爐內(nèi)繼續(xù)重復進行，操作致脫鈣完成；將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水；將浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋；將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，厚4 μm。在20倍光學顯微鏡視野下，每張切片隨機挑選4個不同區(qū)域進行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致，然后記錄軟骨細胞數(shù)和骨細胞數(shù)；對圖片中骨小梁之外的骨組織用Adobe Photoshop CS6進行處理，然后應用Image-Pro Plus 6.0軟件以圖片標尺為標準，將上述處理過的圖片中骨小梁全部選中，進行骨小梁面積的計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0中獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床檢查與腿骨采集

正常肉雞的站立姿勢是在關(guān)節(jié)處有處輕微彎曲(圖1A)，；當肢體偏離身體中線向外彎曲時，這種畸形被歸類為外翻(圖1B和1C)；相反，當右肢或左肢向內(nèi)彎曲，被歸類為內(nèi)翻畸形(圖1D)。通過記錄分析，最早發(fā)現(xiàn)這種骨骼畸形出現(xiàn)在7日齡(圖1B)。在28和38日齡時，分別選擇正常肉雞4只，VVD肉雞6只，處死，采集股骨、脛骨、跖骨 (圖2A)，觀察VVD肉雞腿骨的形態(tài)學變化。如圖2A所示，與正常肉雞長骨相比，VVD雞長骨形狀上發(fā)生扭曲；正常肉雞與VVD肉雞的脛骨曲度(tibal anteroposterior curvature，Tapc)有明顯差異(圖2B)。

圖1 肉雞腿部畸形分類

圖2 肉雞腿部骨骼形態(tài)學比較

2.2 不同日齡肉雞腿部骨骼鈣、磷和灰分測定

28日齡，正常組和VVD組肉雞腿骨中鈣、磷和灰分含量測定結(jié)果如表1所示：VVD雞脛骨中磷含量顯著低于正常組肉雞(P<0.05)，鈣含量和灰分含量差異不明顯，但VVD組中鈣和灰分含量與正常組相比均有下降趨勢。

通過對38日齡正常組和VVD組肉雞腿骨中鈣、磷和灰分含量測定，結(jié)果如表2所示：鈣、磷和灰分含量差異不顯著(P>0.05)，但VVD組肉雞均低于正常組肉雞。

表1 28日齡正常組和VVD腿病組肉雞腿骨中鈣、磷及灰分測定結(jié)果

表2 38日齡正常組和VVD腿病組肉雞腿骨中鈣、磷及灰分測定結(jié)果

2.3 肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量測定

如圖3所示，38日齡VVD雞和健康雞脛骨中銅、錳、鋅含量差異均不顯著，但VVD雞脛骨中銅、錳、鋅含量均略低于正常組肉雞。

圖3 銅、錳、鋅含量測定

2.4 骨組織分析及骨小梁面積、軟骨細胞和骨細胞計數(shù)

如圖4所示，健康雞骨小梁排列緊密，相互連接，無斷裂現(xiàn)象；VVD腿病雞骨小梁變得稀少，并伴有萎縮斷裂現(xiàn)象，骨小梁中白色非礦化區(qū)增多，骨細胞數(shù)明顯減少。如表3所示，VVD組肉雞股骨、脛骨、跖骨骨小梁面積和骨細胞數(shù)均顯著或極顯著低于正常組肉雞(P<0.05或P<0.01)；軟骨細胞數(shù)差異不顯著，但VVD腿病組肉雞軟骨細胞數(shù)多于正常組肉雞。

BT.骨小梁；Ch.軟骨細胞；Os.骨細胞；UR.未礦化區(qū)

表3 38日齡正常組和VVD組肉雞骨小梁面積、軟骨細胞和骨細胞計數(shù)

3 討論

3.1 VVD肉雞骨骼鈣、磷及灰分含量的變化

礦物質(zhì)在家禽骨骼生長發(fā)育過程中起著重要作用。有研究表明，鈣、磷缺乏能夠?qū)е旅劰巧L板肥大區(qū)長度增長，骨骺端生長板增生帶增寬，影響骨骼的生長性能，使骨強度降低，引起骨骼變形或者挫傷，容易發(fā)生骨折[15-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，VVD肉雞血鈣、血磷等血液生化指標發(fā)生紊亂，骨骼性能降低[4]。故本試驗對不同階段肉雞腿部骨骼進行鈣、磷和灰分含量的測定，以探究骨骼中礦物元素含量的變化情況。結(jié)果顯示，28日齡VVD肉雞脛骨磷含量顯著低于健康雞，當機體內(nèi)礦物質(zhì)磷代謝發(fā)生紊亂時，則會引起不同程度的骨骼疾病[8]，但38日齡VVD肉雞脛骨磷含量差異不顯著，由此推測，VVD腿病可能與脛骨磷含量無關(guān)；28、38日齡的鈣含量和灰分含量未達到顯著差異水平，但與健康雞相比，均發(fā)生降低趨勢。說明28、38日齡VVD肉雞股骨、脛骨、跖骨中礦物元素含量雖然除了28日齡磷含量外，其他均無顯著差異，但腿病雞腿部骨骼中礦物元素含量均發(fā)生下降趨勢，VVD腿病的發(fā)生會對其腿部骨骼中礦物元素含量造成一定影響。

3.2 VVD肉雞骨骼銅、錳、鋅含量的變化

微量礦物元素是指機體內(nèi)必需且含量小于0.01%的物質(zhì)，其中銅作為多種酶的輔基，能夠影響破骨細胞的活化與增值，促進骨吸收，使骨含量減少[17]；錳缺乏能夠引起滑腱癥和脛骨短粗，對肉雞骨骼發(fā)育造成影響等[12,18]；有研究發(fā)現(xiàn)，鋅在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，可以促進膠原蛋白合成和增加細胞活性，減少由破骨細胞介導的骨吸收[19]。此外，鋅可以促進成骨細胞分化，有利于骨的形成[20]。張楠[21]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加銅、錳、鋅等微量元素會對蛋雞產(chǎn)蛋性能、血漿指標、激素水平等造成影響。由于骨的正常生長發(fā)育與骨形成和骨吸收密切相關(guān)，而微量礦物元素能夠參與骨代謝過程，故本試驗首次通過直接對肉雞脛骨中微量元素的測定，探究VVD腿病與微量元素之間的關(guān)系。結(jié)果顯示健康雞和VVD肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量之間差異不顯著，但與健康雞相比，VVD肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量均降低。這說明VVD肉雞腿骨微量元素含量存在降低趨勢，但未達到顯著差異水平，猜測可能是肉雞飼養(yǎng)周期較短所致。VVD腿病的發(fā)生與微量元素的關(guān)系還有待于進一步探究。

3.3 VVD肉雞骨骼病理組織學變化

各類腿病的發(fā)生常常會引起骨骼組織學的異常變化，骨小梁是長骨端內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)成部分包括骨小梁及表面附著的礦物質(zhì)，其特定的排列方式對骨的支撐起著重要作用[22]。有研究表明，當骨小梁結(jié)構(gòu)損壞時，會降低骨結(jié)構(gòu)性能，易造成骨骼疾病的發(fā)生[23]。前期研究結(jié)果顯示：當肉雞患VVD后，腿部骨骼骨小梁損傷嚴重，骨小梁中央存在大量白色的未礦化的區(qū)域[5]。本研究骨組織切片分析發(fā)現(xiàn)，VVD腿病雞骨小梁面積顯著降低，骨小梁排列稀疏，說明骨量丟失及微結(jié)構(gòu)破壞嚴重。

軟骨細胞在骨骼生長發(fā)育這一過程發(fā)揮著重要作用，軟骨組織的異常改變是腿部疾病發(fā)生的重要誘因。田文霞等研究發(fā)現(xiàn)，當肉雞患TD后，發(fā)病部位軟骨細胞積聚，影響正常細胞分化，最終擾亂軟骨成骨這一過程[24]。本研究未發(fā)現(xiàn)軟骨細胞數(shù)存在明顯差異，這可能與該腿病的發(fā)病程度及發(fā)病時間有關(guān)，另外VVD腿病的發(fā)生對骨組織中軟骨細胞數(shù)影響較小也是有可能的，但發(fā)病后，骨組織中軟骨細胞數(shù)存在增加趨勢。

骨細胞是成熟骨組織中的主要細胞，維持成熟骨的新陳代謝。呂文亭等[25]對籠養(yǎng)蛋雞綜合征(CLO)的研究發(fā)現(xiàn)，患CLO蛋雞骨小梁中骨細胞數(shù)量減少。本研究結(jié)果顯示，VVD腿病雞骨小梁中骨細胞數(shù)顯著或極顯著低于健康雞，由此推斷VVD會對骨小梁中骨細胞數(shù)造成嚴重影響。因為骨細胞位于骨小梁中，這也與上述結(jié)果VVD病雞骨小梁面積顯著降低相符合。

4 結(jié)論

研究表明，VVD肉雞骨磷含量顯著降低，股骨、脛骨、跖骨中各礦物元素含量均有下降趨勢；此外，該腿病會導致腿部骨骼組織學結(jié)構(gòu)的異常變化，骨小梁面積和骨細胞數(shù)顯著降低，骨骼礦化障礙，骨量丟失，影響其正常的生理特性。