帕托珠利混懸液對靶動物仔豬的安全性評價

王震，許琴瑟，張偉，高嫣珺，聶雅，霍皓遠(yuǎn)，肖文華，卜仕金*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

帕托珠利又名托曲珠利砜，是托曲珠利的一種主要活性代謝產(chǎn)物[1]，不僅具有抗球蟲活性，而且對新孢子蟲、弓形蟲、鞭毛蟲等原蟲也均顯示出良好的活性[2]。德國拜爾公司已率先將該活性成分開發(fā)用于治療馬原蟲性腦脊髓炎(EPM)，并于2001年獲美國FDA批準(zhǔn)上市[3-4]。鑒于托曲珠利在控制仔豬球蟲病方面的成功應(yīng)用，近期湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司研制出一種5%帕托珠利混懸液新制劑，擬用于預(yù)防仔豬球蟲病。前期臨床藥效試驗表明，5%帕托珠利口服混懸液按15～20 mg/kg單次口服給藥，對仔豬球蟲病有良好的防治效果，藥效與20 mg/kg托曲珠利溶液相當(dāng)[5]。本試驗旨在進(jìn)一步評價帕托珠利混懸液對靶動物—哺乳期仔豬用藥的安全性，該研究不僅對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要參考價值，而且是申報新獸藥時必需提供的一項研究資料。

1 材料與方法

1.1 供試藥品

5%帕托珠利口服混懸液(批號20180501)，由湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司提供。

1.2 儀器

貝克曼Unicel Dxc800 synchron型全自動生化分析儀、Sysmex XE-2100型全自動血液分析儀、CX2型OLYMPUS顯微鏡、JA2003型電子天平。

1.3 受試動物及飼養(yǎng)管理

32只3～5日齡健康蘇姜仔豬，公母各半，由江蘇畜牧現(xiàn)代科技園國家級姜曲海豬保種場提供。試驗前采用耳號及豬舍號進(jìn)行識別標(biāo)記。受試仔豬選自4窩母豬。仔豬跟隨母豬分別安置在不同的產(chǎn)床，場所符合分娩母豬要求。仔豬可以自由吮。房間自然通風(fēng)。仔豬在保溫箱中休息，通過電熱板加熱取暖，溫度保持在25～32 ℃。房間溫度保持在18～25 ℃，濕度保持在30%～70%。自然采光，每天采光時間不低于10 h。

1.4 分組及給藥

采用分層區(qū)組隨機(jī)化方法，將32只3～5日齡仔豬隨機(jī)分為4組，每組8只，公母各半[6]。采取多劑量水平給藥，給藥劑量分別為0、1、3、5倍最大推薦劑量。具體分組及給藥如表1。

1.5 給藥途徑及給藥時間

口服給藥，口服時將藥物置于試驗仔豬舌根處讓其自然吞咽。共給藥3次，每次間隔3 d。于最后1次(第9天)給藥結(jié)束繼續(xù)觀察1周。

1.6 試驗期間臨床觀察

給藥前后觀察并記錄受試動物的臨床體征，給藥后6 h每小時觀察一次，之后在8、12、24 h分別進(jìn)行觀察，了解是否有嘔吐或其他異常情況。平時上、下午各1次，觀察內(nèi)容包括但不限于皮膚、被毛、眼睛及分泌物、外觀、口腔分泌物、口腔黏膜、哺乳行為、糞便性狀、呼吸情況和行為等是否有異常。

表1 試驗分組及給藥

1.7 增重和體溫變化

于給藥前第0、5、10、16天逐只進(jìn)行體溫測量和稱重。

1.8 血常規(guī)和血液生化檢測

所有受試仔豬分別在第3次給藥結(jié)束后及觀察期結(jié)束后24 h內(nèi)，于前腔靜脈采集血樣。血樣一分為二，其中一份裝入有抗凝劑的試管進(jìn)行血常規(guī)分析，另一份裝入無抗凝劑試管，析出血清后進(jìn)行血液生化檢查。其中血常規(guī)檢測包括紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板總數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)等參數(shù)，血液生化檢測包括總膽紅素(TBIL)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白/球比(A/G)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)、血糖(GLU)、鈉、鉀、鈣、磷等參數(shù)。

1.9 病理檢查

試驗結(jié)束后，對所有存活的仔豬進(jìn)行撲殺，進(jìn)行大體組織病理學(xué)檢查，如有疑似與藥物相關(guān)的肉眼可見的異常損傷，則采集該異常組織供進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查。對未見明顯異常病變的組織則采集新鮮組織和主要臟器，對采集的組織樣品用10%福爾馬林固定保存，以供進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查[7]。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行顯著性檢驗。各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用方差分析對各組間增重、血液生理生化等指標(biāo)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

試驗期間，空白對照組和各劑量試驗組動物均無死亡。對照組中4406號仔豬精神略差，被毛粗糙，搶奶困難；3倍劑量組中4105號仔豬精神稍差，皮膚干燥，被毛粗糙，搶奶困難。除此外，其他受試動物精神狀態(tài)均良好，給藥后未出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象，吮乳行為及排便等均正常。

2.2 增重與體溫變化

各劑量組體重變化見表2，體溫變化見表3。在完整的試驗期間內(nèi)，數(shù)據(jù)表明1倍劑量組、3倍劑量組相5倍劑量組增重稍大于空白組，但各劑量組之間無顯著差異(P>0.05)。試驗結(jié)束后測得各試驗組體溫低于初始體溫，但保持總體穩(wěn)定。表明5%帕托珠利混懸液對仔豬生長無抑制作用，對仔豬生長不會產(chǎn)生不利影響。

表2 帕托珠利混懸液對仔豬生長性能的影響(n=8)

表3 帕托珠利混懸液對仔豬體溫的影響(n=8) ℃

2.3 血常規(guī)及血液生化參數(shù)檢測結(jié)果

在最后一次給藥結(jié)束后及觀察期結(jié)束后各組仔豬的血常規(guī)及血清生化測定結(jié)果分別見表4～7。

表4 第3次給藥結(jié)束后各組仔豬血常規(guī)參數(shù)測定結(jié)果(n=8)

統(tǒng)計分析顯示：在最后一次給藥結(jié)束后，血常規(guī)與對照組相比，1倍劑量組嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù)差異顯著(P<0.05)；3倍劑量組嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積差異顯著(P<0.05)；5倍劑量組嗜中性粒細(xì)胞差異顯著(P<0.05)，其他無顯著性差異。血清生化測定結(jié)果與對照組相比，1倍劑量組球蛋白、ALT、肌酐和鈣離子差異顯著(P<0.05)，3倍劑量組、5倍劑量組ALT、肌酐差異顯著(P<0.05)。在觀察期結(jié)束后各組血清生化及血常規(guī)參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，且處于正常范圍內(nèi)，表明帕托珠利混懸液在5倍最大推薦劑量下對仔豬的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)無影響。

表5 第3次給藥結(jié)束后各組仔豬血液生化參數(shù)測定結(jié)果(n=8)

表6 觀察期結(jié)束后各組仔豬血常規(guī)參數(shù)測定結(jié)果(n=8)

表7 觀察期結(jié)束后各組仔豬血液生化參數(shù)測定結(jié)果(n=8)

2.4 病理學(xué)變化

試驗結(jié)束后處死各組所有存活仔豬并進(jìn)行尸檢，均未見明顯眼觀病變。對5倍劑量組和對照組仔豬剖檢進(jìn)行組織病理學(xué)檢查均未見明顯異常病變：心肌細(xì)胞排列整齊且間隙正常，無充血及炎性細(xì)胞出現(xiàn)(圖1)；肝細(xì)胞(圖2)、脾細(xì)胞(圖3)形態(tài)完整，肺泡大小正常且無炎性細(xì)胞出現(xiàn)(圖4)；腎小球、腎小囊、腎小管管腔正常(圖5)。此外，十二指腸和空腸皺壁及腸絨毛形態(tài)正常，無脫落萎縮等情況，腸黏膜下層可見腸腺；淋巴結(jié)中皮質(zhì)及髓質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，淋巴竇未見充血現(xiàn)象(圖片略)。

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

3 討論

靶動物安全性研究其實是一種毒性研究，其目標(biāo)是證明在推薦的應(yīng)用條件下藥品對靶動物的安全性、與這種藥物的毒性相關(guān)的癥狀和影響，以及如果5倍的最大推薦劑量水平或更少對靶動物具有毒性，則毒性研究應(yīng)證明這種藥品對動物健康或生產(chǎn)無明顯不良反應(yīng)的最大劑量水平。靶動物安全性試驗通過臨床癥狀觀察、組織病理學(xué)觀察、血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)來發(fā)現(xiàn)尚處在開發(fā)階段的新獸藥，過量和延長用藥時間是否會導(dǎo)致與藥物有關(guān)的不良反應(yīng)，從而確定該藥的安全范圍[8]。

本試驗中，試驗期間所有仔豬均存活，僅對照組和3倍劑量組中各有一頭仔豬因搶奶困難，增重較差外，其他受試動物的精神狀況均良好，哺乳行為、排便均無異常。所有仔豬給藥期間均未出現(xiàn)嘔吐反應(yīng)。第3次給藥結(jié)束后，與空白對照組相比，1倍劑量組的平均嗜酸性粒細(xì)胞含量較高；1倍、3倍、5倍劑量組的平均嗜中性粒細(xì)胞含量均有不同程度升高；3倍劑量組紅細(xì)胞含量、血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞壓積偏低。由于新生仔豬尚處于哺乳階段，各項血液參數(shù)不穩(wěn)定[9]，因此沒有證據(jù)表明與給藥劑量存在相關(guān)性。在觀察期結(jié)束后，各劑量組的平均血常規(guī)參數(shù)間均無明顯差異。

肌酐是肌肉在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)腎小球濾過排出體外。肌酐正常指標(biāo)為44～133 μmol/L，過高的肌酸含量表示腎臟出現(xiàn)損傷，腎功能不全。給藥后血液生化參數(shù)顯示，與空白對照組相比較，各受試藥物組的肌酸水平均稍有升高，但腎臟組織病理學(xué)檢查均未見異常，表明帕托珠利對腎臟無影響。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要分布于肝細(xì)胞中，肝細(xì)胞有炎癥、壞死、中毒等造成肝細(xì)胞損傷時，便會釋放入血，使轉(zhuǎn)氨酶上升[9]。試驗結(jié)束后各劑量組血液生化參數(shù)與空白對照組相比，無顯著性差異，且均在正常范圍內(nèi)，綜合肝臟病理切片表明高劑量5%帕托珠利混懸液對仔豬肝臟無損傷。

本試驗中，5%帕托珠利混懸液3次給藥后，1、3、5倍劑量組與空白對照組相比較，血常規(guī)、血液生化指標(biāo)均差異不顯著，各劑量組之間無明顯差異；對照組和5倍劑量組中剖檢仔豬的主要臟器均未發(fā)現(xiàn)異常，組織病理學(xué)檢查亦未見明顯病理變化。試驗期間未觀察到其他不良事件。研究表明，5%帕托珠利混懸液按推薦劑量使用對仔豬具有較高的安全性。