蓬子菜總黃酮經(jīng)調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響研究

徐 丹，陶永梅，宋 丹，趙冰冰，王 爽，周振興，周 悅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要生理功能是調(diào)節(jié)血管平滑肌張力、抗炎和抗血栓形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致心血管病變的重要因素[1-2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)具有多重生物學(xué)作用，可維持血管壁正常結(jié)構(gòu)，可抗炎、抗癌、保護(hù)動(dòng)脈等；Smad3是TGF-β/Smad3信號(hào)通路中TGF-β下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其表達(dá)水平較高會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)膜增生，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程[3-4]。蓬子菜總黃酮可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)基于TGF-β/Smad3信號(hào)通路探討了蓬子菜總黃酮對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、凋亡的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1藥物及細(xì)胞 蓬子菜總黃酮，純度為75%，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供，批號(hào)：20130115。HUVECs由南京凱基生物技術(shù)有限公司提供。

1.2主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclon公司)；MTT試劑(Sigma公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(卡爾文生物科技有限公司)；TGF-β1、Smad3一抗(美國(guó)R&D公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force公司)；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3HUVECs培養(yǎng)及模型建立 將HUVECs放置在含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用PBS洗滌2遍，加入2 mL消化液(由0.02%的EDTA以及0.25%的胰酶配置)，在37 ℃條件下消化1 min。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙增加后，去除消化液，再次加入2 mL的培養(yǎng)基消化終止。觀察細(xì)胞貼壁情況，配置細(xì)胞懸液，及時(shí)更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分為5組，對(duì)照組HUVECs正常培養(yǎng)；模型組及低、中、高濃度蓬子菜總黃酮組均參考文獻(xiàn)[6]方法建立H2O2氧化損傷模型(確定H2O2氧化損傷最佳的濃度為100 μmol/L，培養(yǎng)時(shí)間為4 h)，然后模型組常規(guī)培養(yǎng)，低、中、高濃度蓬子菜總黃酮組分別加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的蓬子菜總黃酮培養(yǎng)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，摒棄96孔培養(yǎng)皿中的上清液，每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃環(huán)境中孵育4 h，棄掉上清液，每孔中再次加入200 μL的DMSO溶液，在37 ℃環(huán)境中搖床震蕩10 min，通過(guò)全自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm位置觀察吸光度(A)。樣本計(jì)數(shù)選擇300個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞增殖率=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.2細(xì)胞凋亡染色觀察 各組HUVECs在25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種培養(yǎng)，長(zhǎng)至70%，刺激48 h后加入TE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化和收集，加入PBS洗滌后，使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光黃以及碘化丙啶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECs凋亡情況。AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察，樣本計(jì)數(shù)選擇300個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3氧化應(yīng)激、血管功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 同實(shí)驗(yàn)1.3處理細(xì)胞后，取各組細(xì)胞上清液，加入96孔板，用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度(1～10 μg/mL)，每凹孔加0.3 mL，4 ℃過(guò)夜，或37 ℃水浴3 h，貯存于冰箱中。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。每凹孔加入0.2 mL用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37 ℃作用1～2 h。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37 ℃作用1～2 h或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30 min(另設(shè)一空白對(duì)照，0.4 mL底物加0.1 mL終止劑),每凹孔加2 mol/L H2SO4或2 mol/L 檸檬酸0.05 mL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定492 nm處OD值。

1.4.4TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè):同1.3方法處理細(xì)胞后，取各組細(xì)胞上清液，10 000×g離心處理10 min，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100 ℃環(huán)境中加熱5 min(有助于蛋白發(fā)生變性)。凝膠電泳完轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理1 h，使用0.05%～0.1% TBST稀釋一抗(TGF-β1、Smad3一抗為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min，使用0.05%～0.1% TBST稀釋二抗(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，每次5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1各組HUVECs增殖、凋亡情況 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組細(xì)胞增殖率均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；模型組細(xì)胞增殖率、凋亡率與低濃度蓬子菜總黃酮組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；中濃度和高濃度蓬子菜總黃酮組細(xì)胞增殖率均明顯高于模型組和低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，凋亡率明顯低于模型組和低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組增殖率高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)，凋亡率明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組HUVECs凋亡染色情況 對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，表現(xiàn)為綠色彌散狀；模型組凋亡的細(xì)胞表現(xiàn)為紅色、橘紅色，細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生固縮、碎裂，伴隨凋亡小體出現(xiàn)；各濃度蓬子菜總黃酮組凋亡細(xì)胞數(shù)量均有不同程度減少，其中高濃度蓬子菜總黃酮組最明顯。見(jiàn)圖1。

2.3各組HUVECs中氧化應(yīng)激、血管功能指標(biāo)水平 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；各濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；中、高濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中SOD、MDA、ET-1、CGRP水平比較

2.4各組HUVECs中TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)；中、高濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯高于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達(dá)量均明顯低于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白量明顯表達(dá)高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)，Smad3蛋白表達(dá)量明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)。見(jiàn)表3及圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)情況

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡時(shí)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引發(fā)血管疾病[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞增殖率較低，細(xì)胞凋亡率較高，說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞損傷后細(xì)胞增殖被抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；中、高濃度蓬子菜總黃酮組細(xì)胞增殖率均有不同程度的提高，細(xì)胞凋亡率有不同程度的降低，且高濃度蓬子菜總黃酮組效果更明顯。說(shuō)明蓬子菜總黃酮能抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷凋亡，促進(jìn)其增殖，有劑量依賴關(guān)系，與薛鳳等[9]研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)釋放，是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要原因[10]。SOD可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)清除，從而維持細(xì)胞氧化與抗氧化平衡；MDA參與細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，可反映細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重程度[11-12]。蓬子菜總黃酮是蓬子菜中主要的生物活性成分，其可通過(guò)清除自由基，增強(qiáng)抗氧化酶活性起到抗氧化作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組SOD水平均明顯高于模型組，MDA水平均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。證實(shí)蓬子菜總黃酮能明顯減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，且呈濃度依賴，與張紫陽(yáng)等[13]研究結(jié)果一致。

ET屬于一種縮血管活性物質(zhì)，ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其表達(dá)水平過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致血管痙攣，引起組織缺氧缺血，是內(nèi)源性損傷因子；CGRP是一種舒血管生物活性多肽，對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)有重要調(diào)節(jié)作用，是內(nèi)源性保護(hù)因子[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組CGRP水平均明顯高于模型組，ET-1水平均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。說(shuō)明蓬子菜總黃酮能呈濃度依賴性改善血管功能。

TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與動(dòng)脈粥樣硬化有密切關(guān)系，TGF-β1通過(guò)Smad3介導(dǎo)參與動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程,Smad3與TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞增殖與凋亡、免疫監(jiān)督與心血管發(fā)育等有緊密的聯(lián)系[16-17]。張小卿等[18]以5J/cm2UVA輻射HDMEC建立紫外線光損傷的人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型,模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著上升,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β、Smad2/3表達(dá)降低，桃紅四物湯含藥血清能有效保護(hù)UVA誘導(dǎo)的真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與激活TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組，Smad3蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。說(shuō)明蓬子菜總黃酮能激活調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，蓬子菜總黃酮能促進(jìn)HUVECs增殖，抑制其凋亡，可通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善血管功能，從而對(duì)HUVECs起到保護(hù)作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。