健脾補腎方對化學損傷模型小鼠造血系統(tǒng)的影響

肖靜靜，何東初

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430070；2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

現(xiàn)代科技的進步給人類帶來巨大的利益與幫助，但與此同時亦造成越來越多的化學致癌物進入人類的生活和生產(chǎn)領域，可能對人類健康產(chǎn)生損害，而造血系統(tǒng)又是此類損傷主要的受累部位[1]。有害化學物質誘導的氧化應激是造血細胞損傷的重要機制[2]，化學損傷后造血細胞及其微環(huán)境中活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生增加，超過體內抗氧化系統(tǒng)的清除能力，機體則不能準確地修復造血祖細胞和造血干細胞中DNA損傷，導致造血祖細胞和造血干細胞凋亡，造血祖細胞增殖減少，誘導造血干細胞自我更新及定向分化能力下降，損傷骨髓基質細胞導致造血干細胞龕穩(wěn)態(tài)紊亂，最終導致骨髓抑制，骨髓衰竭[3]。造血細胞生長因子(hematopoietic growth factors,HGFs)對化學損傷導致的骨髓抑制具有一定的療效，但其價格昂貴，并且其也會影響造血干細胞功能，加重造血干細胞功能損傷[4]。因此，尋找有效改善造血功能且安全、經(jīng)濟、毒副作用小的治療藥物成為目前化學損傷領域研究的重點。健脾補腎方(既往稱地甘口服液)在中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床應用十余年，在防治輻射及化學損傷方面取得了滿意的療效。前期臨床試驗表明該方能預防及治療腫瘤放化療患者外周血象的下降，改善造血功能，并且能提高患者的免疫功能[5-6]。前期動物實驗表明該方能增強化學損傷小鼠骨髓細胞周期素基因(cyclinD1)和造血細胞及基質黏附分子(CD45、VCAM-1)的表達，減少脾臟及骨髓相關凋亡基因(bcl-2、bax)表達，促進造血細胞的增殖，抑制其凋亡等[7-12]。本研究觀察健脾補腎方對化學損傷小鼠造血細胞氧化損傷及造血細胞凋亡的影響，揭示其對化學損傷保護作用的機制，為臨床推廣應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 選取8～12周健康純系小鼠60只，體重18～22 g，雌雄兼用，由湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:42000600004104。

1.2藥物 健脾補腎方由熟地黃、炙甘草、當歸、黃芪、澤瀉、陳皮組成，由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中藥制劑室制備，經(jīng)水煎、過濾、濃縮后，制成100% 濃度(含生藥1 g/mL)和200% 濃度(含生藥2 g/mL)的藥液，分裝備用。鯊肝醇，廣州康和藥業(yè)有限公司，批號：20100725。

1.3主要試劑及儀器 DMEM、胎牛血清、胰酶(Trypsin-EDTA)，美國Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶，Corning公司；紅細胞分離液，武漢巴菲爾公司；淋巴細胞分離液，武漢巴菲爾公司；GM-SF、低熔點瓊脂糖、胎牛血清、谷氨酰胺；活性氧檢測試劑盒，碧云天公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；熒光酶標儀，美國BioTek公司。

1.4實驗方法 60只小鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機選擇12只作為正常組，其余小鼠采用環(huán)磷酰胺以100 mg/kg的劑量腹腔注射，每天1次，連續(xù)3 d。造模成功后將小鼠隨機分為模型組、健脾補腎方小劑量組、健脾補腎方大劑量組、鯊酐醇組各12只。模型組和正常組小鼠用生理鹽水灌胃，健脾補腎方小劑量組和健脾補腎方大劑量組分別用100%濃度健脾補腎方和200%濃度健脾補腎方灌胃，鯊酐醇組給予鯊肝醇混懸液0.1 g/kg灌胃，均0.2 mL/10 g，2次/d。于灌胃第9天處死各組小鼠，收集外周血、骨髓進行相關檢測。

1.5檢測指標及方法

1.5.1外周血常規(guī)檢測 全自動血液分析儀測定外周血中白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平。

1.5.2骨髓細胞ROS水平檢測 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。分離骨髓單核細胞，將細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，調整細胞濃度為106個/mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分除去未進入細胞內的DCFH-DA。取正常標記有DCFH-DA的細胞加入活性氧陽性對照刺激細胞，設濃度梯度為50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、0 mg/mL。37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min。用熒光酶標儀測定熒光強度，熒光強度直接反映了細胞內的氧自由基水平。

1.5.3粒細胞巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)檢測 采用體外單層瓊脂半固體培養(yǎng)法檢測：制備各組小鼠骨髓單核細胞懸液，培養(yǎng)體系包括50 ng/mL GM-CSF，20%胎牛血清，瓊脂終濃度為0.3%，4 mmol/L谷氨酰胺，配制2×105/mL細胞懸液。于37 ℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14 d觀察集落形成情況，以大于40個細胞的細胞團為一個集落。

2 結 果

2.1各組小鼠外周血常規(guī)比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，健脾補腎方小、大劑量組外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白水平和鯊肝醇組外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白水平均明顯升高(P均<0.05)，鯊酐醇組血小板回升不顯著(P>0.05)；健脾補腎方小劑量組各指標改善情況均明顯優(yōu)于健脾補腎方大劑量組和鯊肝醇組(P均<0.05),接近正常水平。見表1。

表1 各組小鼠外周血常規(guī)比較

2.2各組小鼠骨髓細胞ROS水平和CFU-GM比較 與正常組比較，模型組小鼠骨髓細胞內ROS水平明顯升高(P<0.05)，骨髓細胞 CFU-GM 明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，健脾補腎方小、大劑量組和鯊酐醇組骨髓細胞內ROS水平明顯降低(P均<0.05)，骨髓細胞 CFU-GM 明顯增加(P均<0.05)，其中健脾補腎方小劑量組各指標改善情況均明顯優(yōu)于健脾補腎方大劑量組和鯊肝醇組(P均<0.05)，接近正常水平。見表2及圖1～5。

圖1 正常組小鼠粒細胞巨噬細胞集落形成情況

表2 各組小鼠骨髓細胞ROS水平和CFU-GM比較

3 討 論

化學損傷屬中醫(yī)“虛勞”“血虛證”范疇，病變涉及五臟。中醫(yī)認為“脾為氣血生化之源”，“腎主骨，生髓藏精”，“血為精所化”。故腎虛則髓不足，精不足則血衰，說明脾、腎、骨髓和血液之間存在密切的關系，通過健脾補腎可達生血的目的。健脾補腎方重用熟地、甘草為君藥，其中熟地可滋陰補血，填精益髓;甘草可補益脾氣，益氣復脈。黃芪補脾肺之氣，以益生血之源;當歸補血亦可活血，促進祛瘀生新，共為臣藥。陳皮理氣健脾，行氣導滯，可防止補益藥之滋膩，為佐藥；澤瀉宣泄腎濁，引藥歸經(jīng)，為使藥。諸藥合用可健脾益氣、滋陰補腎、養(yǎng)血益髓?，F(xiàn)代藥理學研究表明，地黃多糖可促進骨髓造血干細胞的增殖與分化，升高外周血象[13-14]。甘草能夠增強骨髓細胞增殖分化能力，刺激骨髓造血[15]。當歸可顯著促進造血干細胞的增殖，并延緩其衰老，促進多種造血祖細胞的增殖、分化；當歸多糖還可通過延緩骨髓基質細胞衰老，促進黏附分子、血管生長因子、造血生長因子的分泌從而改善造血微環(huán)境來促進造血功能的恢復[16]。黃芪能促進輻射損傷小鼠造血干細胞的增殖和分化，能使損傷的脾臟向正常逆轉，并可清除輻射導致的氧化損傷，能夠改善因放化療引發(fā)的骨髓抑制狀態(tài)[17-18]。澤瀉能夠促進放化療后組織損傷分解代謝產(chǎn)物的排泄[19]。陳皮可改善脾胃運化功能，促進造血營養(yǎng)物質的吸收，改善免疫功能，有抗腫瘤、抗突變作用[20]?？梢娊∑⒀a腎方具有促進造血功能恢復的作用。

圖2 模型組小鼠粒細胞巨噬細胞集落形成情況

圖3 健脾補腎方小劑量組小鼠粒細胞巨噬細胞集落形成情況

圖4 健脾補腎方大劑量組小鼠粒細胞巨噬細胞集落形成情況

圖5 鯊酐醇組小鼠粒細胞巨噬細胞集落形成情況

外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平主要反映造血干/祖細胞向成熟細胞分化的能力，CFU-GM 可反映造血干/祖細胞體外增殖能力，ROS升高是照射引起骨髓造血干/祖細胞損傷的重要因素。本研究采用環(huán)磷酰胺腹腔注射方法建立化學損傷模型，顯示化學損傷后小鼠外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平明顯降低，骨髓細胞內ROS水平明顯升高，骨髓細胞CFU-GM明顯減少，提示造模成功。與模型組比較，健脾補腎方小、大劑量組外周血白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平明顯恢復，骨髓細胞內ROS水平明顯降低，骨髓細胞CFU-GM明顯增加。說明健脾補腎方對化學損傷所致的造血系統(tǒng)分化異常有保護作用，可提高造血干/祖細胞的增殖分化能力，其保護作用可能是通過清除ROS，減輕造血系統(tǒng)的氧化損傷而實現(xiàn)的。本實驗中，健脾補腎方小劑量組各指標改善情況均優(yōu)于大劑量組，可能與健脾補腎方中大劑量熟地黃、甘草滋膩之性影響胃腸道吸收有關，這說明健脾補腎方在治療化學物質所致的造血功能損傷時存在一定的量效關系，而非劑量越大越好的依賴關系，其具體機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。