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    5 種蒿屬植物提取物對(duì)馬鈴薯晚疫病的抑菌活性研究

    2021-07-08 08:32:36何彥儀羅雨薇許美瀅竺永金鄭紅宇胡世俊閆曉慧
    關(guān)鍵詞:牛尾餾分晚疫病

    何彥儀 羅雨薇 許美瀅 竺永金 鄭紅宇 胡世俊 閆曉慧

    (1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650233;2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650233)

    馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophtora infestans)引起、對(duì)馬鈴薯(Solanum tuberosum)具有毀滅性的疾病[1]。馬鈴薯晚疫病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播、危害大、難防控,已經(jīng)超過(guò)水稻稻瘟病和小麥銹病,被視為國(guó)際第1 大作物病害[2-3]。馬鈴薯晚疫病的防治措施均以化學(xué)防治為主,輔以簡(jiǎn)易的生物防治與物理防治?;瘜W(xué)農(nóng)藥的使用次數(shù)和劑量的增加在一定程度上促使致病菌株產(chǎn)生抗藥性,造成環(huán)境污染與農(nóng)藥殘留等問(wèn)題,導(dǎo)致防治效果降低[4]。植物源農(nóng)藥具有對(duì)生態(tài)環(huán)境安全、非靶標(biāo)生物影響較小、原材料來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn),因此從植物中尋找新的殺菌抑菌活性物質(zhì)、研制開(kāi)發(fā)新型植物源農(nóng)藥是當(dāng)下的熱點(diǎn)[5]。

    牛尾蒿(Artemisia dubia)隸屬菊科(Compositae)蒿屬(Artemisia),為中國(guó)特有種,生于海拔3500 m 以下的山坡、草原、疏林及林緣地,主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南、西藏等省份[6]。研究表明,蒿屬植物及其活性化合物被認(rèn)為具有抗瘧、抗氧化、驅(qū)蟲(chóng)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗微生物等作用[7]。牛尾蒿為我國(guó)傳統(tǒng)藏藥,可作牲畜飼養(yǎng)材料;結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道,牛尾蒿具有多種生物活性,如對(duì)煙草甲(Lasioderma serricorne)具趨避活性、抗豬流行性腹瀉病毒等[8–10];目前牛尾蒿在應(yīng)用研究上大多為藥用上的研究,有研究指出牛尾蒿提取物對(duì)人體致病菌,如白色念珠菌(Candida albicans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和大腸桿菌(Escherichia coli)均有不同程度的抑制活性[11]。

    本研究以5 種蒿屬植物的乙醇提取物為供試材料,對(duì)2 株馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定并進(jìn)行活性成分篩選,為深入研究其抑菌活性成分、防治馬鈴薯晚疫病提供了新思路,也為植物源新農(nóng)藥的先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)[12-13]。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 植物材料

    植物材料于2018 年5—8 月份采自云南昆明(102°10′~103°40′E,24°23′~26°22′N)、遼寧喀左(119°24′~120°23′E,40°47′~41°33′N)(表1),由西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定,植物樣品保存于云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

    表1 供試植物名錄Table 1 List of tested plants

    1.1.2 供試菌株

    馬鈴薯晚疫病菌pn5502 和pn7604 菌株,由云南省農(nóng)科院趙志堅(jiān)研究員提供。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    本實(shí)驗(yàn)采用黑麥培養(yǎng)基。按照黑麥60 g、瓊脂18 g、白砂糖15 g、水1000 mL 的比例制作黑麥培養(yǎng)基。

    1.2 儀器與試劑

    N?1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司,中國(guó))、柱層析硅膠及GF254 薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠,中國(guó));72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑(上海杜邦農(nóng)化有限公司,中國(guó)),試劑甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿及二甲基亞砜(云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司,中國(guó))等試劑均為分析純。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 植物提取物及牛尾蒿提取物不同餾分的制備

    植物材料風(fēng)干粉碎,采用乙醇回流提取法[14],分別提取3 次,每次4 h。合并3 次提取液,再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀,得到乙醇提取物備用。牛尾蒿提取物經(jīng)常壓硅膠柱層析,以石油醚、石油醚?丙酮(V石油醚∶V乙酸乙酯=30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1)、氯仿?甲醇(V氯仿∶V甲醇=1∶1)等溶劑系統(tǒng)依次進(jìn)行梯度洗脫,經(jīng)薄層層析檢測(cè),合并相同組分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收溶劑,得到Fr1~Fr1010 個(gè)不同餾分。

    1.3.2 抑菌活性測(cè)定方法

    已純化的馬鈴薯晚疫病菌在無(wú)菌環(huán)境下挑取菌絲接到黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng),每4~5 d進(jìn)行1 次,直至病菌長(zhǎng)滿平板,在菌落邊緣打菌餅備用[15]。采用帶毒平板法[16-17]測(cè)定5 種蒿屬植物粗提物抑菌活性,將植物提取物用二甲基亞砜(DMSO)配置成100 mg/mL 的母液并采用巴氏消毒法對(duì)母液進(jìn)行滅菌備用,無(wú)菌條件下將一定量的母液加入即將冷卻的已滅菌黑麥培養(yǎng)基中并充分混勻,使提取物最終濃度為1 mg/mL,以含等量DMSO 溶劑的黑麥培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(CK),陽(yáng)性對(duì)照為同濃度的霜脲·錳鋅。待培養(yǎng)基凝固后,每皿中央接入1 個(gè)菌餅(Φ=5 mm),每個(gè)處理重復(fù)3 次;28 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),采用十字交叉法對(duì)菌落進(jìn)行測(cè)量,記錄其平均直徑。按公式(1)~(2)計(jì)算抑制率。

    1.3.3 抑制中濃度(EC50)測(cè)定方法

    將牛尾蒿乙醇提取物餾分Fr1制成0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL 5 個(gè)濃度的帶毒平板,觀察2 株馬鈴薯晚疫病菌的生長(zhǎng)情況,根據(jù)Fr1在不同濃度下對(duì)2 株菌的抑制效果,分別針對(duì)2 株菌設(shè)定濃度梯度進(jìn)行毒力測(cè)定:1)對(duì)菌株pn7604 濃度為62.5、31.25、15.625、7.8125、0 μg/mL;2)對(duì)菌株pn5502 濃度為1、5、2.5、1.25、0 μg/mL。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    運(yùn)用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì),采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析,分別求出各供試組分的毒力回歸方程、EC50值、95%置信區(qū)間和決定系數(shù)(R2)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 5 種植物粗提物的抑菌活性

    由表2 可知,5 種植物提取物在1 mg/mL 下對(duì)2 株供試病原菌有不同程度的抑菌作用,抑菌率為28.08%~89.04%,不同提取物抑菌作用存在極顯著差異(P<0.01),其中牛尾蒿提取物對(duì)供試菌株pn5502、pn7604 的抑菌活性最強(qiáng),抑菌率分別為89.04%和71.38%。

    表2 5 種植物粗提物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502、pn7604 的抑制率Table 2 Results of the antifungal activities of 5 plant crude extracts against pn5502 and pn7604 strains of P. infestans

    2.2 牛尾蒿各餾分對(duì)供試菌株的抑菌活性篩選

    由表3 可知,餾分Fr1在0.5 mg/mL 下對(duì)2 株供試菌有顯著抑菌活性,抑制率均高達(dá)100%,此外餾分Fr2、Fr5、Fr6也顯示出較高的抑菌效果,抑菌率均在50%以上。

    表3 牛尾蒿的不同餾分對(duì)馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502 的抑制率Table 3 Antifungal activity of different fractions of A.dubia against pn5502 of P. infestans

    根據(jù)表4 的活性測(cè)定結(jié)果,擬合出各提取物的毒力方程見(jiàn)表5;陽(yáng)性對(duì)照對(duì)pn5502、pn7604 的EC50分別為273.8000、155.0000 μg/mL;Fr1對(duì)pn5502、pn7604 的EC50分別為7.4733、9.4634 μg/mL,明顯高于陽(yáng)性對(duì)照。

    表4 牛尾蒿餾分Fr1 濃度梯度活性篩選Table 4 Concentration gradient activity screening of A.dubia Fr1

    表5 Fr1、霜脲·錳鋅對(duì)pn5502、pn7604 抑制的回歸分析Table 5 The concentration for 50% of maximal effect of Fr1,cymoxanil·mancozeb on pn5502 and pn7604

    2.3 牛尾蒿提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響

    由圖1 可知,牛尾蒿Fr1餾分處理后的2 株馬鈴薯晚疫病菌與CK 有明顯差異。正常生長(zhǎng)的pn5502、pn7604 菌絲體粗細(xì)均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布,受抑制的菌絲均產(chǎn)生明顯的畸變,F(xiàn)r1(31.25 μg/mL)處理的pn5502、pn7604 菌絲變得粗大分枝較多,且分枝間距密集,菌絲體內(nèi)含物聚集,細(xì)胞壁不光滑,出現(xiàn)明顯畸形。霜脲·錳鋅(250 μg/mL)處理的pn7604 菌絲形態(tài)與Fr1(31.25 μg/mL)處理相似,表明餾分Fr1對(duì)pn5502、pn7604 菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制效果,且活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照。

    圖1 pn5502、pn7604 菌絲生長(zhǎng)情況顯微圖Fig.1 Micrograph of mycelium growth of pn5502 and pn7604

    3 結(jié)論與討論

    目前防治馬鈴薯晚疫病主要依靠培育抗病品種和施用化學(xué)藥劑,由于致病疫霉遺傳變異迅速,已出現(xiàn)能克服現(xiàn)有全部抗病基因的菌株,且致病疫霉屬于卵菌,無(wú)細(xì)胞甲殼素和麥角固醇,單獨(dú)使用殺菌劑防治效果差,難以完全有效地控制該病,且單純依靠傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治具有局限性[18-20],因此尋找新的安全的防治方法勢(shì)在必行。近年來(lái),生物防治已成為研究熱點(diǎn),利用植物源提取物和微生物農(nóng)藥防治馬鈴薯晚疫病受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。已有研究表明知母水提取物、九里香乙醇粗提物對(duì)致病疫霉的生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子釋放有顯著的抑制作用,且提取物的抑制作用與濃度呈正相關(guān),EC50值分別為1.91 mg/mL和6.51 mg/mL,地果甲醇提取物濃度為1 mg/mL時(shí)抑菌率達(dá)90%[21-24]。本研究篩選了5 種蒿屬植物提取物對(duì)2 株馬鈴薯晚疫病菌的抑制活性,結(jié)果表明5 種提取物在濃度為1 mg/mL 的濃度下均對(duì)供試菌株具有一定的抑菌活性,其中牛尾蒿提取物對(duì)馬鈴薯晚疫病病菌pn5502 和pn7604 的抑菌活性均為最高,青蒿提取物次之;進(jìn)一步對(duì)牛尾蒿提取物的抑菌活性成分進(jìn)行了追蹤,發(fā)現(xiàn)餾分Fr1具有顯著抑菌活性,在濃度為0.5 mg/mL對(duì)2 株供試菌株的抑菌率均高達(dá)100%,并且呈顯著的劑量效應(yīng),經(jīng)不同濃度梯度測(cè)定餾分Fr1對(duì)pn5502、pn7604 的EC50值分別為7.4733 μg/mL、9.4634 μg/mL 顯著高于陽(yáng)性對(duì)照藥劑霜脲·錳鋅,其對(duì)2 株菌的EC50分別為273.8 μg/mL 和169 μg/mL,顯微觀察發(fā)現(xiàn)被餾分Fr1處理后的菌絲會(huì)出現(xiàn)明顯的畸形,因此有必要進(jìn)一步闡明其抑菌活性成分,及其作用機(jī)制。楊立賓等[25]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉發(fā)酵液乙酸乙酯提取物降低了致病疫霉菌體可溶性蛋白含量,降低菌體保護(hù)酶活性,使菌體丙二醛含量升高,提高菌體電導(dǎo)率,降低菌體呼吸速率,致病疫霉系統(tǒng)清除自由基出現(xiàn)障礙、細(xì)胞膜被破壞、電解質(zhì)外露,對(duì)致病疫霉有直接抑制作用。林敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)亞磷酸鹽作為新型植物誘抗劑,除直接作用于致病疫霉菌絲的生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子的釋放外,還可以通過(guò)刺激植物體內(nèi)抗病物質(zhì)的產(chǎn)生和積累等起到間接防病作用。本研究發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)的致病疫霉菌絲體粗細(xì)均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布,而牛尾蒿餾分Fr1處理后病原菌菌絲體出現(xiàn)分枝增多、表面粗糙、內(nèi)含物聚集等現(xiàn)象,與陽(yáng)性對(duì)照藥劑霜脲·錳鋅處理的癥狀類似,表明致病疫霉處于明顯的脅迫條件。上述異常癥狀的出現(xiàn)可能與牛尾蒿餾分Fr1中存在的活性成分破化了菌體的正常代謝,使得菌體細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)大量積累,嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致菌絲出現(xiàn)畸形。牛尾蒿是我國(guó)傳統(tǒng)的藏藥,具有很高的藥用價(jià)值[27]。牛尾蒿農(nóng)用研究多為飼喂牲畜、精油化學(xué)成分研究、生物多樣性研究、土壤重金屬修復(fù);目前對(duì)牛尾蒿生物活性的篩選和評(píng)價(jià)大多停留在其精油的殺蟲(chóng)活性[28-31],而對(duì)其化學(xué)成分在殺蟲(chóng)、抑菌等生物農(nóng)藥活性方面報(bào)道相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)了牛尾蒿提取物在離體條件下對(duì)馬鈴薯晚疫病菌良好的抑菌活性,豐富了牛尾蒿生物活性的范疇,后續(xù)我們可以進(jìn)一步進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)其在田間防治馬鈴薯晚疫病的實(shí)際防效,闡明具體的活性成分及其作用機(jī)制,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)綠色無(wú)公害、環(huán)境友好型植物源農(nóng)藥[32]提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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