水楊酸誘導(dǎo)的月季對甜菜夜蛾的抗性及機理研究

唐 敏 程 靜 許雁祥 朱國磊 楊發(fā)忠

（西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)與草原局重點實驗室，西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650233）

植物激素水楊酸（SA）是一種廣泛存在于植物體中的小分子酚類物質(zhì)[1-2]，在植物體中主要通過異分支酸合酶（ICS）途徑和苯丙氨酸解氨酶（PAL）途徑合成[3]。SA 是植物體內(nèi)重要的免疫激素，對多種重要代謝過程起到調(diào)控作用，包括病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI），在這些植物先天免疫系統(tǒng)中，SA 發(fā)揮了重要作用[4]。在病原物入侵植株時，植物通常啟動水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR），從而減少病原物侵染對植物造成的危害[5]。如月季（Rosa chinensis）受到月季白粉菌（Podosphaera pannosa）的侵染時，植物體內(nèi)SA含量上升，從而增強對白粉菌入侵的適應(yīng)性[6]。

與此同時，SA 也可以作為外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)多種植物對多種生物脅迫產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性。已有研究表明，同一植物上的病害和蟲害之間存在著寄主植物介導(dǎo)的間接的病蟲互作關(guān)系，而SA 是這種互作關(guān)系的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在這一過程中起著重要作用[7]。內(nèi)外源SA 均可能誘導(dǎo)植物在產(chǎn)生抗病性的同時增強植物對植食性害蟲的抗性。如外源SA 處理能增強番茄（Lycopersicon esculentum）植株對煙粉虱（Bemisia tabaci）的抗性[8]。在SA 的誘導(dǎo)作用下，植株次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，對害蟲產(chǎn)生間接防御[9]，可能釋放含特異性成分的揮發(fā)物，作為天然信息化合物，被昆蟲用于識別寄主植物的適合性，間接抵制昆蟲的危害[10]。其中，SA 誘導(dǎo)黃瓜（Cucumis sativus）產(chǎn)生具有驅(qū)避作用的萜烯類物質(zhì)，從而對西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的取食、產(chǎn)卵產(chǎn)生影響，使黃瓜植株對西花薊馬產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性[11]。

但是截至目前，仍不清楚外源水楊酸誘導(dǎo)是否能增強月季植株對甜菜夜蛾的抗性，同樣，SA處理月季后是否會誘導(dǎo)月季揮發(fā)性成分（VOCs）發(fā)生變化也是未知的。因此將采用外源SA 對月季植株進行誘導(dǎo)，研究其對甜菜夜蛾的影響，并通過頂空動態(tài)吸附法原位收集月季枝條的揮發(fā)物，通過GC?MS 分析明確其組成及含量變化，測試SA 誘導(dǎo)月季新合成的化合物對甜菜夜蛾是否具有生物活性，以期探明SA 誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的化學(xué)機理。

1 材料與方法

1.1 材料來源和儀器試劑

1.1.1 植物與昆蟲

供試昆蟲甜菜夜蛾、供試植物月季幼苗均采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉種植基地用于切花月季（艷粉）生產(chǎn)的大棚中。

1.1.2 儀器與試劑

美國Agilent Technologies 公司HP6890GC/5973 MS 氣相色譜?質(zhì)譜（GC?MS）聯(lián)用儀；吸附劑為Porapak Q（80～100 目，Waters，USA）；正己烷和丙酮均為色譜純；水楊酸（SA）以及包括正構(gòu)烷烴在內(nèi)的所有用于GC?MS 分析和產(chǎn)卵實驗的標(biāo)準(zhǔn)品（共40 種）購自百靈威公司，含量≥99%。

1.2 研究方法

1.2.1 月季栽培

將采回的健康無病蟲害的中國月季幼苗用基質(zhì)進行栽培，進行適時澆水、施肥、防病蟲害等正常管理，防止白粉菌侵染。培育條件為溫度27 ℃、濕度70%、光周期12 h/d，至嫩枝達30 cm左右用于實驗中。

1.2.2 甜菜夜蛾飼養(yǎng)

甜菜夜蛾幼蟲采回后置于養(yǎng)蟲盒內(nèi)用月季葉片飼養(yǎng)至化蛹，待成蟲羽化后置于產(chǎn)卵籠內(nèi)交配、產(chǎn)卵，籠內(nèi)放置蘸10%蜂蜜水的棉球補充成蟲營養(yǎng)，放入健康月季枝條供其產(chǎn)卵。采集帶有即將孵化的卵塊的月季葉片，放入鋪有濕潤濾紙的養(yǎng)蟲盒中，并放入部分新鮮月季葉片，待卵孵化后自由取食。每天觀察，及時更換中國月季葉片。飼養(yǎng)條件為溫度27 ℃、濕度70%、光周期12 h/d?；己筠D(zhuǎn)入潤濕的土壤中保濕，以防止蛹失水過多而死亡。并嚴格認真做好整個飼養(yǎng)過程中殺菌消毒的工作，防止甜菜夜蛾幼蟲受到核型多角體病毒或顆粒體病毒感染。

1.2.3 產(chǎn)卵測試I

SA 用少量乙醇溶解，并用v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑，稀釋至1 mmol/L[12]。選取健康無病蟲害的月季植株，用SA 溶液進行葉面噴施，每天1 次，每株每次5 mL；對照組用相應(yīng)溶劑同法噴施。連續(xù)處理6、9、12 d 后，分別采集處理組和對照組枝條，各1 束，每束4 枝，插入有水的燒杯中。將兩束枝條對角放入用細鐵絲紗網(wǎng)自制的產(chǎn)卵籠中，分開50 cm，中間放置蘸有10%蜂蜜水的棉球，放入飛翔正常、雌雄配對的甜菜夜蛾成蟲4 對，讓其任意選擇在2 種枝條上產(chǎn)卵。實驗開始后的第3 天、第5 天、第7 天分別記錄產(chǎn)卵量，記錄完畢更換同法處理的新鮮枝條，并計算產(chǎn)卵量的每雌均值，重復(fù)5 次。用總產(chǎn)卵量計算抑制指數(shù)（II）：

式中：OCK表示對照枝條上的產(chǎn)卵量，OT表示SA 處理后的枝條上的產(chǎn)卵量。

1.2.4 揮發(fā)性成分捕集

參照Giusto 等[13]的方法，采用動態(tài)頂空吸附（DHSA）法，不將枝條剪下，在活體月季植株上對揮發(fā)性成分（VOCs）進行原位捕集。將1 枝經(jīng)SA 處理6 d 后的枝條封入PET 袋（耐受溫度>200 ℃）中，從下部通入氣流?？諝饬飨冉?jīng)過活性炭、去離子水，再經(jīng)過裝有吸附劑Porapak Q的玻璃吸附管進入袋中，并從PET 袋上部抽出、經(jīng)過第2 個Porapak Q 吸附管。進出口氣流量分別為600 mL/min 和500 mL/min，以保證外界氣體不進入PET 袋。收集時間8 h，完成后將第2 支吸附管取下，用5 mL 正己烷將月季釋放的VOCs混合物從吸附劑上洗脫下來，?80 ℃保存?zhèn)溆?。共? 枝枝條上收集，合并捕集物，實驗前N2頂吹濃縮，用于GC?MS 分析和產(chǎn)卵實驗。SA 處理9、12 d 后的枝條 以及對照植株的VOCs 同 法收集。

1.2.5 產(chǎn)卵測試II

將1.2.4 中分別從SA 處理過的植株和對照植株收集的VOCs 用v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑分別稀釋至5 mL。選取健康無病蟲害、未經(jīng)任何處理的月季枝條2 束，分別用2 種VOCs 稀釋液噴施，并按照1.2.3 中的方法進行產(chǎn)卵實驗。

1.2.6 GC?MS 分析

采用GC?MS 法分析兩類月季VOCs 混合物中各物質(zhì)的組成和含量，并采用相同方法進行背景扣除（不放入月季枝條）。GC 條件：HP?5 MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫：起始溫度40 ℃，程序升溫3 ℃/min 至80 ℃，再程序升溫5 ℃/min 至260 ℃；氣流量為1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；進樣量2.0 μL；不分流，載氣為高純氦氣。MS 條件：電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.2.7 單體活性測試

根據(jù)GC?MS 結(jié)果選擇需要進行活性測試的化合物，這類化合物在正常月季植株中不會合成，只有在SA 的誘導(dǎo)作用下才會合成出來的新化合物，可能在月季抗蟲過程中起到重要作用。將所選化合物配制成0.1、0.5、2.5、12.5 mg/mL溶液（v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑），按1.2.5 的方法噴施到2 束月季枝條上同法進行產(chǎn)卵實驗，計算抑制指數(shù)II。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)GC?MS 檢測結(jié)果，對有標(biāo)準(zhǔn)品的40 種化合物采用外標(biāo)法定量；對未能購買到標(biāo)準(zhǔn)品的4 種化合物，選擇保留時間與之最相近的正構(gòu)烷烴作為外標(biāo)物進行定量。結(jié)果用每小時內(nèi)每克新鮮嫩枝釋放的揮發(fā)物的質(zhì)量（ng/(g·h)）表示。定性鑒定方法：1）通過GC?MS 檢測所得信息和wiley7n.l 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進行比較；2）根據(jù)正構(gòu)烷烴計算出目標(biāo)化合物的科瓦茨指數(shù)并與文獻比較；3）與NIST 數(shù)據(jù)庫在相同分析條件下的數(shù)據(jù)進行比較；4）與標(biāo)準(zhǔn)品進行對照。

產(chǎn)卵量差異統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0（IBM?SPSS，USA）中的單因素方差分析（ANOVA）進行（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸誘導(dǎo)對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響

直接采用水楊酸（SA）處理過的月季枝條及對照枝條進行甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為生物測試，所得結(jié)果如圖1 所示，圖1 中A、B、C 分別為SA 處理6、9、12 d 的枝條。從該結(jié)果可以看出，SA誘導(dǎo)了月季植株對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，使雌蛾在SA 處理后的植株上產(chǎn)卵量明顯減少。從總產(chǎn)卵量來看，處理6、9、12 d 后，產(chǎn)卵量與對照相比均顯著下降，差異達到顯著水平（P<0.05）。根據(jù)總產(chǎn)卵量計算，處理6、9、12 d 對應(yīng)的抑制指數(shù)II分別為35.4%、38.9%、47.5%，隨著處理時間延長，II增加，抑制作用存在明顯的時間效應(yīng)，亦即，SA 處理對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的抑制作用增強。從產(chǎn)卵開始后的各時間段來看，除了圖1a 中產(chǎn)卵時間為7 d 時的產(chǎn)卵量外，其他各時段的產(chǎn)卵量與對照相比均存在顯著性差異（包括圖1a?c）。

圖1 SA 誘導(dǎo)月季植株對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.1 Effect of induction of R.chinensis plants by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

與此同時，先將SA 處理的植株和對照植株頂空VOCs 提取出來，再將VOCs 混合物配成溶液噴施兩束相同的未經(jīng)處理的健康月季枝條，讓甜菜夜蛾自由選擇在噴施后的2 種月季枝條上產(chǎn)卵，測試SA 處理的月季VOCs 對產(chǎn)卵行為的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 SA 誘導(dǎo)的月季頂空揮發(fā)性成分混合物對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.2 Effect of the mixtures of headspace R.chinensis volatiles induced by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

從圖2 可以看出，在噴施了SA 處理后提取的揮發(fā)物的枝條上甜菜夜蛾的產(chǎn)卵量與對照相比顯著減少。SA 處理后月季揮發(fā)物對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為具有明顯的抑制作用，隨著處理時間延長，抑制作用增強，與對照相比差異均達到顯著水平（P<0.05）。SA 處理6、9、12 d 后揮發(fā)物對產(chǎn)卵行為的抑制指數(shù)II分別為23.9%、25.4%、36.2%（根據(jù)總產(chǎn)卵量計算），也表現(xiàn)出明顯的時間效應(yīng)。

綜合圖1 和圖2 的結(jié)果來看，SA 處理誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為產(chǎn)生了明顯抑制作用，主要原因是SA 誘導(dǎo)了月季VOCs 變化，這種變化能被甜菜夜蛾成蟲明顯地識別出來，從而避免在SA 處理過的月季上產(chǎn)卵。結(jié)果表明SA 誘導(dǎo)的月季VOCs 變化在甜菜夜蛾產(chǎn)卵地選擇過程中起到重要作用。

2.2 GC?MS 分析

GC?MS 分析結(jié)果（表1）表明，SA 處理誘導(dǎo)了月季揮發(fā)性成分（VOCs）顯著變化。從化合物種類看，未經(jīng)處理的月季頂空VOCs 主要包含萜類（52.43%）、醛類（25.38%）、芳香族類（17.12%）、烴類（3.73%）；SA 處理6 d 后主要包含萜類（28.85%）、芳香族類（24.11%）、醛類（22.73%）、酯類（8.42%）；9 d 后主要包含萜類（42.75%）、芳香族類（15.70%）、醛類（14.96%）、酯類（9.10%）；12 d 后主要包含萜類（32.83%）、醇類（15.38%）、芳香族類（13.80%）、羧酸類（11.41%）。其中，含量變化最大的是醇類，SA 處理12 d 后與對照相比增加了5.85 倍，從對照的2.63%增加到15.38%；而萜類則從對照的52.43% 下降到32.83%，僅為對照的2/3 左右。

表1 SA 誘導(dǎo)的月季植株揮發(fā)性成分變化Table 1 Change of SA?induced volatiles released by R.chinensis plants

從單體化合物看，SA 誘導(dǎo)12 d 后，有10 種單體消失（未檢出）；21 種單體含量下降，其中，β?石竹烯、(E)?2?己烯?1?醇、β?欖香烯、芳樟醇與對照相比下降程度最大，分別下降了89.68%、76.25%、72.08%、65.07%；5 種化合物含量上升，其中，十六烷上升了118.77%、α?松油醇上升了92.71%；新增單體化合物8 種（在CK 中未檢出），其中，十四烷醇從CK 中的0.00%增加至12.94%，增幅最大。

簡言之，SA 誘導(dǎo)的月季植株頂空揮發(fā)物最明顯的變化是β?石竹烯釋放量減少，以及誘導(dǎo)植株新合成了十四烷醇。

另外，在8 種SA 誘導(dǎo)新增的化合物中，十四烷醇、2?乙基己酸、棕櫚酸甲酯和乙酸十六酯這4 種化合物，處理12 d 后的含量分別為12.94%、11.41%、6.02%、5.32%，在所有新增化合物中含量最大。4 種化合物的含量均隨著SA 處理時間的延長而逐漸增加，表現(xiàn)出明顯的時間效應(yīng)（如圖3 所示）。

圖3 SA 誘導(dǎo)4 種月季單體揮發(fā)物含量變化的時間效應(yīng)Fig.3 Temporal effect of the changes in contents of 4 SA?induced monomer volatile in R.chinensis

2.3 單體化合物對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響

將SA 誘導(dǎo)月季新合成的4 種單體化合物（十四烷醇、2?乙基己酸、棕櫚酸甲酯和乙酸十六酯）配置成溶液，噴施于健康枝條上測試它們對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響，結(jié)果如圖4 所示?？梢钥闯?，隨著4 種單體的濃度增加，抑制指數(shù)II增加，表明它們對產(chǎn)卵的抑制作用增強，顯示出明顯的濃度效應(yīng)，表明它們都有較強的活性。其中，十四烷醇的活性最強，在較低濃度下就對產(chǎn)卵產(chǎn)生了較強的活性，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時，抑制指數(shù)就已超過35%。其他3 種化合物則在施用濃度大于2.5 mg/mL 時，對甜菜夜蛾的產(chǎn)卵行為產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖4 SA 誘導(dǎo)的4 種單體活性成分對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.4 Effect of 4 SA?induced active mono-chemicals on ovipositional behaviour of S.exigua

3 結(jié)論與討論

用外源水楊酸（SA）處理月季植株可使植株產(chǎn)生對甜菜夜蛾的誘導(dǎo)抗性，從化學(xué)機理角度看，主要與月季揮發(fā)性成分變化有關(guān)。結(jié)果表明，SA 處理能使甜菜夜蛾在植株上的產(chǎn)卵量顯著減少，隨著處理時間延長，對產(chǎn)卵的抑制作用也增強；在噴施了從處理植株上提取的揮發(fā)性成分混合物的枝條上，產(chǎn)卵量顯著減少；處理6、9、12 d 后，抑制指數(shù)分別為23.9%、25.4%、36.2%。據(jù)此，從化學(xué)機理角度看，揮發(fā)性成分變化是SA 誘導(dǎo)抗性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通常認為，植物體內(nèi)SA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與植物抗病性有關(guān)[2]。但是近年來，也有研究表明SA處理增強了植株的抗蟲性[8]。SA 處理能夠誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，從而間接地對昆蟲的危害產(chǎn)生抗性。這其中，植物揮發(fā)性成分（VOCs）起到了重要作用[8]。已有研究表明，白粉菌侵染月季能夠誘導(dǎo)植株對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，原因同樣與VOCs 有關(guān)，與SA 誘導(dǎo)的抗性十分類似。白粉菌誘導(dǎo)了月季VOCs 變化，誘導(dǎo)產(chǎn)生的VOCs混合物對甜菜夜蛾有十分明顯的驅(qū)避作用[14]。研究結(jié)果進一步表明，在白粉菌?月季?甜菜夜蛾組成的三元系統(tǒng)中，SA 途徑在寄主植物介導(dǎo)的間接的病蟲互作過程中起到了重要作用。

GC?MS 結(jié)果表明，SA 處理誘導(dǎo)了月季VOCs發(fā)生了顯著變化，既有物質(zhì)種類的變化，也有含量的變化。也有研究表明還可能僅僅是2 種化學(xué)成分的比例發(fā)生變化[15]。這些化學(xué)信息常常被正在尋找產(chǎn)卵地的昆蟲做為天然信息化合物，用于識別寄主植物適合性，從而增加后代的成活率（即“媽媽知道理論”）[16-17]。從結(jié)果來看，甜菜夜蛾能夠明顯地識別出SA處理過的月季植株，寧愿在未處理過的植株上產(chǎn)卵，而避免SA 處理過的月季植株。原因包括，一是具有引誘活性的成分含量下降，如SA 誘導(dǎo)了芳樟醇和β?欖香烯含量下降；二是具有驅(qū)避活性的單體化合物在SA 的誘導(dǎo)作用下被月季合成出來，甜菜夜蛾能夠準(zhǔn)確識別這些天然信息化合物，并避免在釋放這些化合物的植株上產(chǎn)卵。其中，SA 誘導(dǎo)月季新合成的具有驅(qū)避活性的化合物有4 種，包括2?乙基己酸、十四烷醇、棕櫚酸甲酯、乙酸十六酯，在未處理的月季植株中正常情況下不會合成，但在SA 的誘導(dǎo)作用下能夠合成，具有明顯的時間效應(yīng)，并且隨著處理時間的延長，含量增加，這類化合物最有可能被甜菜夜蛾做為信息化合物用于識別寄主植物是否適合繁衍生息；結(jié)果正好表明它們對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為有明顯的驅(qū)避作用。并且，產(chǎn)卵生物測試結(jié)果也表明，這4 種化合物對甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的抑制作用表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。而在這4 種化合物中，驅(qū)避活性最強的是十四烷醇。白粉菌侵染月季也誘導(dǎo)了十四烷醇含量顯著上升[6]，只是之前的研究未證實其對甜菜夜蛾有驅(qū)避活性。所得結(jié)果不僅闡明了SA 誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的化學(xué)機理，也進一步表明，白粉菌侵染月季誘導(dǎo)植株對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，與SA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

本研究結(jié)果還表明，SA 可以用于月季上的甜菜夜蛾的防治。同時，SA 誘導(dǎo)的月季揮發(fā)性成分混合物以及十四烷醇等單體化合物也可用于該蟲防治。這些物質(zhì)來源于天然，在自然界有著完整的降解途徑，可用于植物保護，可實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的綠色無公害防治。