不同產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉次生代謝物與土壤微生物的關(guān)系分析

徐小博 王選年 徐 萍 岳永德 湯 鋒 王 進(jìn) 姚 曦

（1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.國際竹藤中心，北京 100102）

土壤是影響植物次生代謝成分的主要因素，土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，土壤微生物不僅對土壤動植物殘體和土壤有機(jī)物質(zhì)及其他有害化合物的分解起到重要作用，而且在土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)變化中的作用也不能忽視，在一定程度上可以反映土壤肥力狀況及其生產(chǎn)力水平[1-3]。例如叢枝菌根（AM）真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布的優(yōu)秀微生物資源，AM 真菌通過根內(nèi)菌絲與宿主植物體形成營養(yǎng)上的互利共生關(guān)系，在促進(jìn)植物生長、提高抗逆性、改良土壤結(jié)構(gòu)等方面的作用效果顯著[4]。藥用植物與根際微生物互作一直是研究的熱點(diǎn)[5]。黃花蒿（Artemisia annua）、刺五加（Acanthopanax senticosus）和魚腥草（Houttuynia cordata）等藥用植物的次生代謝產(chǎn)物與土壤因子關(guān)系[6-8]、以及土壤有益菌對植物次生代謝產(chǎn)物影響的研究較多[9]。通過對野生黃花蒿（Artemisia annua）土壤特征對藥用次生代謝產(chǎn)物的影響研究發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性與青蒿素、青蒿酸含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能夠提高黃花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。金司陽等從植物?土壤反饋角度結(jié)合次生代謝產(chǎn)物的含量方法，分析了刺五加幼苗在植物?土壤反饋中的次生代謝產(chǎn)物的變化情況[7]。竹葉中含有豐富的黃酮類、有機(jī)酸等次生代謝產(chǎn)物，有重要的藥用價值，但存在活性成分含量不穩(wěn)定等問題[10-11]。植物產(chǎn)地是影響植物次生代謝產(chǎn)物的重要因素之一，不同地區(qū)環(huán)境中微生物種類和優(yōu)勢菌群不盡相同[11-12]。竹子次生代謝產(chǎn)物的研究多集中在次生代謝產(chǎn)物的種類和時間變化上[13-14]，但地域差異對竹葉次生代謝產(chǎn)物影響的研究較少，竹葉次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)地差異及其與竹林土壤微生物特征之間的關(guān)系尚不清楚。此外，竹葉中次生代謝產(chǎn)物會通過淋溶、凋落物等途徑進(jìn)入土壤，對土壤微生物群落產(chǎn)生影響，進(jìn)而間接影響植物的生長發(fā)育，這個問題也同樣值得關(guān)注。

高節(jié)竹（Phyllostachys prominens）為禾本科竹亞科剛竹屬的重要經(jīng)濟(jì)竹種，是一種集觀賞、生態(tài)防護(hù)、筍用、材用于一體的多用竹種，主要在分布浙江，全國多地有引種，經(jīng)濟(jì)價值高[15]。因此，本研究以高節(jié)竹為試材，測定了不同產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉次生代謝產(chǎn)物含量以及土壤中3 種土壤微生物數(shù)量、微生物生物量和土壤酶活性，探討竹葉中次生代謝產(chǎn)物含量與土壤微生物因子的相關(guān)性。本研究為了解土壤微生物對竹葉次生代謝產(chǎn)物積累的影響，以及不同竹林目標(biāo)化種植和提高次生代謝產(chǎn)物累積的研究提供參考。

1 研究地概況

由南向北選擇4 個有高節(jié)竹分布或者引種的代表性研究地，分別為江蘇南京、浙江富陽、江西南昌、福建武夷山。研究地的基本概況如下：1）江蘇南京：位于南京市溧水區(qū)東南部的南京林業(yè)大學(xué)白馬基地（119°10′～119°11′E、31°35′～31°36′N），屬亞熱帶季風(fēng)氣候。年平均氣溫15.4 ℃年，平均降雨量1106.5 mm。2）浙江富陽：位于杭州市富陽區(qū)永昌鎮(zhèn)（119°25′～120°19.5′E、29°44～30°11′N），屬中亞熱帶季風(fēng)氣候。年平均氣溫16.1 ℃，年平均降水量1 426 mm。3）江西南昌：位于南昌市梅嶺國家森林公園塘下村（115°48′～115°49′E、28°44′～28°45′N），屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫17～17.7 ℃，年平均降雨量1600～1700 mm。4）福建武夷山：位于福建省武夷山風(fēng)景區(qū)（117°24′12″～118°02′50″E，27°32′36″～27°55′15″N），屬典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫8.5～18.0 ℃，年平均降雨量1 482～2 150 mm。

2 材料與方法

2.1 竹葉樣品采集和處理

在4 個研究地，選擇高節(jié)竹試驗(yàn)林經(jīng)營水平一致，長勢良好的高節(jié)竹竹林，分別設(shè)置3 個20 m×20 m 的樣地，每個樣地 中隨機(jī)設(shè) 置3 個3 m×3 m 的小樣方。在每個小樣方采集竹葉，采集立竹年齡為2 a 的上、中、下部的健康葉片，然后混勻，取樣量500 g。每個試驗(yàn)地共9 個竹葉樣品。樣品采集后自然陰干至恒質(zhì)量，粉碎，保存于4 ℃冰箱中。竹葉采樣時間在2018 年9 月中旬。

2.2 土壤樣品的采集

在2.1 的每個樣地內(nèi)布設(shè)5 個土樣采集點(diǎn)，采集0～20 cm 深度的土壤樣品，取樣時去除土壤表層凋落物及其他雜物，并剔除土壤中植物根系和石塊。每個樣品采樣量為1.0 kg 左右，共20 份樣品，裝入無菌袋放于帶冰塊的泡沫箱內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，用于土壤微生物數(shù)量、土壤微生物生物量及土壤酶活性的測定。

2.3 儀器與試劑

Waters 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2487二極管陣列檢測器；異葒草苷、葒草苷、對香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素（純度>98%）（上海源葉生物生物技術(shù)有限公司）；色譜乙腈，（美國Fisher 公司）。

2.4 高效液相色譜檢測方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品制備及HPLC 檢測條件參考魏琦等的方法[16]，10 種次生代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜見圖1。按照保留時間依次是異葒草苷、葒草苷、對香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷、木犀草素和芹菜素。

圖1 10 種次生代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 10 secondary metabolites

2.5 土壤微生物相關(guān)指標(biāo)的測定方法

細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量測定參考許光輝等[17]和王理德等[18]的方法，微生物數(shù)量用cfu/g（每克樣品的菌落數(shù)）表示。

土壤微生物生物量碳（SMBC）和生物量氮（SMBN）測定參考文獻(xiàn)[19]方法。蛋白酶活性和脲酶活性的測定采用比色法測定[20]，蔗糖酶活性采用3,5?二硝基水楊酸比色法[21]。

2.6 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2010 計(jì)算數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等，并完成圖表制作。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行Pearson 法相關(guān)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉次生代謝含量分析

由表1 可知，4 個產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉中所含次生代謝產(chǎn)物種類一致，被檢測的次生代謝產(chǎn)物總量在1.777 9～3.176 2 mg/g，其中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷含量高于其他成分。不同產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉中異葒草苷的含量在0.877 3～2.133 6 mg/g，其中，浙江富陽最高，是福建武夷山（最低）的2.43 倍。各產(chǎn)地竹葉中葒草苷含量在0.308 2～0.573 1 mg/g。各產(chǎn)地竹葉中牡荊苷含量在0.167 1～0.258 9 mg/g，浙江富陽的顯著高于其他3 個產(chǎn)地，是江蘇南京（最低）的1.55倍。各產(chǎn)地竹葉中苜蓿素7?O?葡萄糖苷含量在0.101 8～0.256 3 mg/g。浙江富陽的最高，是江西南昌（最低）的2.52 倍，但和江蘇南京差異不顯著。各產(chǎn)地的對香豆酸的含量在0.007 9～0.020 5 mg/g，異牡荊苷的含量在0.008 9～0.016 5 mg/g，蘆丁的含量在0.044 1～0.061 3 mg/g，木犀草苷的含量在0.053 2～0.144 9 mg/g，芹菜素的含量在0.010 0～0.028 5 mg/g。4 個產(chǎn)地均未檢測到木犀草素。

表1 4 個產(chǎn)地竹葉樣品中9 種次生代謝物的含量Table 1 Contents of 10 secondary metabolites from 4 producing areas mg/g

3.2 不同產(chǎn)地高節(jié)竹林土壤微生物相關(guān)指標(biāo)分析

由表2 可知，4 個研究區(qū)的土壤微生物總量由高到低依次是福建武夷山、浙江富陽、江蘇南京和江西南昌。福建武夷山的土壤細(xì)菌數(shù)量最高，為17.50×106cfu/g，依次分別是浙江富陽（9.25×106cfu/g）、江蘇南京（8.94×106cfu/g）和江西南昌（7.36×106cfu/g），其中浙江富陽和江蘇南京兩地差異不顯著。土壤真菌數(shù)量為江蘇南京土壤樣品最高，為3.99×104cfu/g，顯著高于其他3 個產(chǎn)地，浙江富陽、江西南昌和福建武夷山的土壤真菌數(shù)量相互之間差異顯著。福建武夷山的放線菌數(shù)量顯著高于浙江富陽、江西南昌和江蘇南京，為4.33×104cfu/g，江蘇南京和江西南昌竹葉樣品之間差異不顯著。

表2 不同產(chǎn)地竹林土壤3 種微生物數(shù)量的比較Table 2 Comparison of soil microbial quantity in bamboo from different producing areas cfu/g

由表3 可以看出，浙江富陽的土壤樣品SMBN顯著高于福建武夷山、江西南昌和江蘇南京。浙江富陽的土壤樣品SMBC 最高，依次分別是江西南昌、江蘇南京和福建武夷山的土壤樣品。江西南昌和福建武夷山的樣品的SMBN 之間差異不顯著；福建武夷山樣品的SMBC 顯著低于其他地區(qū)的，浙江富陽和江蘇南京樣品的SMBN 差異不顯著。

表3 不同產(chǎn)地土壤微生物量碳和氮及3 種土壤酶的比較Table 3 Comparison of soil microbial biomass C and N,and 3 enzyme activities from different areas

由表3 可以看出，來自江蘇南京土壤樣品的脲酶和蔗糖酶活性顯著高于其他地區(qū)的，4 個產(chǎn)地樣品中浙江富陽的蛋白酶活性最高，依次分別是福建武夷山、江蘇南京、江西南昌；江蘇南京的土壤脲酶活性最高，依次分別是福建武夷山、江西南昌和浙江富陽。江蘇南京的高節(jié)竹林土壤蔗糖酶活性最高，依次分別是江西南昌、福建武夷山和浙江富陽。

3.3 竹葉次生代謝含量與土壤微生物的相關(guān)性分析

由表4 可知，竹林土壤細(xì)菌數(shù)量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關(guān)關(guān)系，與異葒草苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素?7?O?葡萄糖苷、芹菜素和總量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；土壤真菌數(shù)量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，與葒草苷、對香豆酸和牡荊苷存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；土壤放線菌與葒草苷、對香豆酸、牡荊苷含量存在正相關(guān)關(guān)系，與異葒草苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、芹菜素和次生代謝產(chǎn)物總量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；微生物量氮和微生物量碳均與竹葉中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、木犀草苷、苜蓿素?7?O?葡萄糖苷和次生代謝產(chǎn)物總量存在正相關(guān)關(guān)系，與對香豆酸、異牡荊苷和芹菜素存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中與對香豆酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。高節(jié)竹竹葉次生代謝相關(guān)產(chǎn)物的含量與土壤中3 種酶活性的相關(guān)性不顯著。說明土壤酶活性不是活化土壤所吸收養(yǎng)分的主要因素。

表4 竹葉次生代謝產(chǎn)物含量和土壤微生物的相關(guān)性Table 4 Correlation between content of secondary metabolites in bamboo leaves and soil microorganism

4 結(jié)論與討論

1）不同產(chǎn)地次生代謝物差異。植物所含次生代謝產(chǎn)物含量的高低除與遺傳因素有密切關(guān)系外，所生存的環(huán)境和氣候條件等生態(tài)因子對其也有很大的影響。本研究中高節(jié)竹竹葉中代謝產(chǎn)物的總量具有明顯的地域差異，表明竹葉中次生代謝產(chǎn)物的合成和積累受環(huán)境因子的影響較大。各氣象因子如溫度、濕度、光照、大氣以及生物之間的影響程度等綜合決定的環(huán)境因子對植物次生代謝過程的影響，所以環(huán)境因子并不是孤立地對植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量起作用，而是多種因素不斷變化[22]。

2）土壤微生物數(shù)量與竹葉次生代謝物的關(guān)系。植物體內(nèi)次生代謝物的量和土壤微生物存著相互關(guān)系。土壤微生物也會通過參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、礦質(zhì)元素運(yùn)輸而影響植物自身次生代謝物的合成，尤其是一些土壤有益菌發(fā)揮的作用更不容忽視。植物根際促生菌（PGPR）和菌根真菌（AM）對植物生長、養(yǎng)分吸收和次生代謝物的產(chǎn)生具有有益的影響，這些植物的次生代謝物包括酚類、黃酮、生物堿等[3,23]。相關(guān)性分析表明竹林土壤細(xì)菌數(shù)量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關(guān)關(guān)系。研究也發(fā)現(xiàn)土壤微生物與魚腥草次生代謝相關(guān)產(chǎn)物存在相關(guān)性。細(xì)菌群與阿福豆苷和槲皮素含量呈極顯著正相關(guān)，細(xì)菌群落對于酚類物質(zhì)中的阿福豆苷、槲皮苷、槲皮素的代謝累計(jì)起到一定的促進(jìn)作用[24]。推測某些竹林土壤細(xì)菌的生理活動，影響了土壤養(yǎng)分及根系，進(jìn)而促進(jìn)了竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷的生物合成及積累。土壤真菌數(shù)量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，推測在高節(jié)竹竹林土壤可能存在某些菌根真菌，能通過菌絲體將礦質(zhì)營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)街参锔H供其吸收，促進(jìn)高節(jié)竹體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物合成，值得進(jìn)一步研究。

3）土壤酶活性與竹葉次生代謝物的關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)4 個產(chǎn)地竹葉中異葒草苷的含量均顯著高于其他成分，浙江富陽的異葒草苷的含量最高，同時該地土壤中蛋白酶活性也最高，推測土壤蛋白酶也間接影響著異葒草苷的生物合成，有機(jī)質(zhì)中的絕大多數(shù)化合物不能直接被植物吸收利用，需要借助土壤中微生物釋放的酶來分解[25-26]。但通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)高節(jié)竹竹葉次生代謝相關(guān)產(chǎn)物的含量與土壤中3 種酶活性的相關(guān)性不顯著。馮玄在研究次生代謝產(chǎn)物與土壤特征的相關(guān)性時也發(fā)現(xiàn)，魚腥草次生代謝相關(guān)產(chǎn)物的含量與土壤中的酶活性相關(guān)性不顯著。說明在高節(jié)竹和魚腥草這2 種植物上，土壤酶活性不是活化土壤所吸收養(yǎng)分的主要因素[24]。但是，趙鋮等研究表明土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性與青蒿素、青蒿酸含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能夠提高黃花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。說明不同植物的不同次生代謝產(chǎn)物對土壤相關(guān)酶降解的養(yǎng)分需求不同。

不同產(chǎn)地高節(jié)竹竹葉中次生代謝物的種類一致，且均為異葒草苷含量最高，但不同產(chǎn)地的含量差異明顯。竹林土壤細(xì)菌數(shù)量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關(guān)關(guān)系，土壤真菌數(shù)量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系。綜上所述，土壤微生物特征能夠影響高節(jié)竹竹葉次生代謝產(chǎn)物的積累，但是不同次生代謝產(chǎn)物對土壤微生物特征的響應(yīng)不同增加土壤細(xì)菌可以提高高節(jié)竹竹葉葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量，增加土壤真菌可以提高高節(jié)竹竹葉異葒草苷和木犀草苷。在實(shí)際生產(chǎn)中可以嘗試調(diào)節(jié)土壤微生物特征來實(shí)現(xiàn)高節(jié)竹竹葉目標(biāo)次生代謝成分的提高。