毛竹種子萌發(fā)及無菌水培技術(shù)研究

黃孝風 ，鐘秋蔚 ，鄒 娜*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 園林與藝術(shù)學(xué)院；b. 江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點實驗室，江西 南昌 330045）

毛竹（Phyllostachys edulis）又名楠竹，隸屬禾本科竹亞科剛竹屬，生長快、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、材質(zhì)好、用途廣，是我國面積最大、分布最廣、經(jīng)濟價值最高的竹種之一［1-3］。毛竹主要分布在長江以南，以湖南、安徽、福建、江西、浙江等省份的分布面積最廣［4］。毛竹的開花周期長且難以預(yù)測，終身開花一次并在種子發(fā)育成熟后死亡，一旦毛竹成片開花，就會造成大面積的竹林死亡［5］。由于其自身的生物學(xué)特性，長期以來人們一直沿用埋鞭等無性繁殖的方式發(fā)展竹林，通過無性繁殖可以將選出的優(yōu)良無性系進行擴大繁殖，獲得最大的遺傳增益［6］。但挖苗、種植都費工費力，而且消耗竹材，成本高、效率低，嚴重地制約了毛竹林面積和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［7-8］。而毛竹種子育苗投資少、成本低，遠低于母竹造林，起運栽植方便，造林成活率高，為開花竹林的更新及引種提供了新的途徑和技術(shù)［9-10］。

毛竹種子無休眠，成熟后即能發(fā)芽，可隨采隨播。目前室內(nèi)播種多采用濾紙法萌發(fā)種子，但在實驗條件下，毛竹種子在濾紙上發(fā)芽率不高；并且在濾紙上發(fā)芽時，霉菌容易擴散，而霉菌感染種子后，會影響種子進一步萌發(fā)成苗，使得毛竹實生苗培育的研究和應(yīng)用受到了很大的限制［9-11］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，切去種子大部分胚乳，可減少或消除污染所造成的影響，但種子胚乳保留量少，其萌發(fā)的幼苗長勢普遍較弱。另外，將毛竹種子在培養(yǎng)基中發(fā)芽時，發(fā)芽率可達到80%，顯著高于濾紙上的發(fā)芽率，但需要相應(yīng)的設(shè)備，技術(shù)上要求比較高。

無土栽培指不用天然土壤，以水、草炭、蛭石等介質(zhì)作為植物根系的基質(zhì)，利用含有植物生長發(fā)育所必需元素的營養(yǎng)液來提供營養(yǎng)，植物根系直接生長在營養(yǎng)液中，使植物能夠正常地完成整個生命周期的種植技術(shù)［12-14］。無土栽培技術(shù)由于可以人為控制營養(yǎng)液中的鹽分、養(yǎng)分、溶解氧、酸堿度和溫度等環(huán)境，在蔬菜、花卉苗木栽培中得到了廣泛的應(yīng)用［15］。無土栽培根據(jù)栽培介質(zhì)不同分為水培、霧（氣）培和基質(zhì)栽培。水培是指植物根系直接與營養(yǎng)液接觸，而不使用基質(zhì)的栽培方法。但水培的技術(shù)要求比較高，在營養(yǎng)液循環(huán)的設(shè)施中和高溫高濕的環(huán)境條件下，病菌更易快速繁殖而侵染植物，甚至長出綠藻，成為水培試驗的一大難題［16］。在本次試驗中，通過剝皮、浸種、消毒處理以及播種方式的對比研究，探索適用于生產(chǎn)和研究的毛竹種子萌發(fā)方式；同時，在水培條件下通過不同水質(zhì)及通氣處理的研究，探索適宜的幼苗生長條件，為毛竹生產(chǎn)和研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為毛竹種子，采自廣西桂林灌陽縣洞井鄉(xiāng)，千粒重約30 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子浸種催芽、去皮、消毒與播種 毛竹種子在40 ℃溫水中浸泡過夜，去掉或保留穎果果皮；不消毒或用75% 酒精浸泡5 ～ 10 s，再用不同濃度的 NaClO 溶液劇烈振蕩浸泡10 ～ 20 min，最后用去離子水沖洗6 ～8 遍；播在鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿、鋪有滅菌脫脂棉及紗布的一次性餐盒或裝有蛭石的花盆中。試驗設(shè)6 個處理，每個處理3 個重復(fù)，每種器皿播種30 粒種子。其中，以對毛竹種子不處理，直接播入蛭石為對照。

1.2.2 毛竹無菌水培體系的建立 將在蛭石中萌發(fā)生長1 個月、大小基本一致的毛竹幼苗，用自來水沖洗根部，將附著的蛭石等沖洗干凈，切除1/2 根系，轉(zhuǎn)入不同水質(zhì)（無菌水、自來水、雙濾水）和通氣條件（不通氣、加濾嘴單過濾、加濾盤單過濾、加濾嘴濾盤雙過濾）的處理中進行水培試驗。每隔一天更換一次水。研究不同水質(zhì)和通氣處理對毛竹水培污染的影響，試驗設(shè)8 個處理，每個處理4 個重復(fù)，每個重復(fù)5 株苗。

1.2.3 毛竹水培幼苗生長 在上述研究的基礎(chǔ)上，探討不同水質(zhì)（無菌水、自來水、雙濾水）及通氣處理（加濾盤單過濾）對毛竹水培苗生長的影響。營養(yǎng)液每隔一天更換一次，試驗設(shè)6 個處理，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)8 株苗。

1.3 生長條件

培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：白天溫度（25 ± 1）℃，晚上溫度（18 ± 1）℃，光照時間16 h/d，光照強度2 000 Lx，濕度70%。播種后每天觀察種子發(fā)芽及污染情況，及時補充水分。毛竹實生苗轉(zhuǎn)入水培體系后待苗長出新根，轉(zhuǎn)入水培營養(yǎng)液，并且由1/4 濃度過度到1/2 濃度再到全營養(yǎng)液，每個濃度處理4 d，至全營養(yǎng)液后加氮（4 mmol/L NH4NO3）處理。營養(yǎng)液基本成分同文獻［17］。所有處理營養(yǎng)液的pH 值調(diào)節(jié)在4.0 左右。

1.4 測定項目及方法

播種第2 天開始記錄種子污染情況，計算種子污染率。播種28 d 統(tǒng)計毛竹種子發(fā)芽率和污染率。發(fā)芽率= 28 d 時的出苗數(shù)/供試種子總數(shù)× 100%；污染率= 污染數(shù)/接種數(shù)× 100%。水培幼苗在每次換水時觀察污染情況，第12 天統(tǒng)計各處理中通氣管、水面、盆底和幼苗根部污染情況，并統(tǒng)計幼苗生長各指標（苗高、葉片數(shù)、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重、地下部干重）。苗高使用直尺測定，指根莖結(jié)合部到頂部的高度，精確至0.1 cm。葉片數(shù)為植株全展葉片數(shù)量。將水培幼苗分為地下和地上兩部分，濾紙吸干表面水分稱重得到各部位的鮮重，經(jīng)殺青（105 ℃，30 min）后70 ℃烘干至恒重并稱重得到各部位的干重，單位為g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2007 進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計分析采用SPSS13.0，以P＜ 0.05 為差異顯著，采用LSD法進行多重比較。圖表使用Sigmaplot13.0 生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同播種前處理及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響

不同播種前處理方法及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響見表1。從表1 可以看出，對照條件下（處理1），毛竹種子發(fā)芽率為21.95%；處理3 和處理4 的發(fā)芽率與處理1 的差異達到顯著水平，說明播種前處理顯著影響毛竹種子發(fā)芽。其中，經(jīng)40 ℃溫水浸泡催芽、去皮、并用75%酒精浸泡5 ～ 10 s 和20% NaClO 消毒20 min 后，播入蛭石中發(fā)芽率最高（處理4），達51.48%，且在發(fā)芽過程中沒有污染。而帶皮消毒后播入餐盒及濾紙中的兩個處理（處理5、6）與播入蛭石中的處理相比，不僅發(fā)芽率低，而且污染率較高。處理3、5 和6 的發(fā)芽率和污染率差異都達到了顯著水平，說明毛竹種子發(fā)芽率也受到不同播種基質(zhì)的影響。

2.2 不同消毒處理及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響

在2.1 研究的基礎(chǔ)上，進一步研究了不同濃度NaClO 和消毒時間及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響，結(jié)果見表2。表2 結(jié)果表明，10% NaClO 消毒20 min 后播入蛭石發(fā)芽率最高，達61.76%。不同播種基質(zhì)對毛竹種子發(fā)芽率的影響整體為蛭石＞脫脂棉紗布＞濾紙，但在同一播種基質(zhì)的各不同濃度NaClO 處理間，毛竹種子發(fā)芽率差異不大。方差分析結(jié)果（表3）表明，不同NaClO消毒處理對毛竹種子發(fā)芽率影響差異不顯著（P＞0.05），而不同播種基質(zhì)對毛竹種子發(fā)芽有極顯著的影響（P＜ 0.01）。

表1 不同前處理方法及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effects of different pretreatment and sowing stroma on the germination of Phyllostachys edulis seeds

表2 不同消毒處理及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of different disinfection treatments and sowing stroma on the germination of Phyllostachys edulis seeds

表3 不同消毒處理及播種基質(zhì)對毛竹種子萌發(fā)的方差分析Tab.3 Variance analysis of different disinfection treatments and sowing stroma on the germination of Phyllostachys edulis seeds

2.3 不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹幼苗無菌水培體系污染的影響

不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹無菌水培體系污染的影響見表4。由表4 可以看出，毛竹在雙濾水中培養(yǎng)且通氧加濾盤濾嘴的生長狀況最佳（處理4），在水培過程中，通氣管、水面、盆底均無污染，根部污染率僅10%。在不通氧的自來水水質(zhì)處理1 中，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)在水面上有油漬狀污染，并且根部污染率高達95%，顯著高于其他處理；而在通氧處理2 中，污染主要發(fā)生在通氣管口及管壁，水面污染率顯著下降，幼苗根部污染率為0，由此說明自來水中含有的雜菌，在氧氣含量高的地方快速繁殖，不利于毛竹無菌水培。處理2、4 和8 的結(jié)果表明，通過改善水質(zhì)，水培培養(yǎng)體系（通氣管、水面和盆底）的污染可以得到徹底解決，并且使用雙濾水或無菌水差異不大。無論是在雙濾水處理（3、4）中，還是無菌水處理（5 ～ 8）中，雙層過濾所通入的空氣，與不過濾或單層過濾空氣的處理相比，可以明顯改善培養(yǎng)無菌環(huán)境或減少根部污染率（處理4、8）。

表4 不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹無菌水培體系污染的影響Tab.4 Effects of different water quality and aeration treatment on the pollution of Phyllostachys edulis aseptic hydroponic system

2.4 不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹幼苗生長的影響

在上述研究基礎(chǔ)上，進一步探究不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹幼苗生長的影響，結(jié)果見表5。由表5 可知，毛竹幼苗在通氧或者不通氧的自來水中培養(yǎng)均存在污染（處理2、5），而其他處理的污染率均為零，并且差異達到顯著水平，說明水質(zhì)對毛竹無菌水培體系起重要作用，雙濾水或無菌水作為毛竹水培用水較好，而自來水不適合做水培用水。

表5 不同水質(zhì)及通氣處理對毛竹幼苗生長的影響Tab.5 Effects of different water quality and aeration treatments on the growth of Phyllostachys edulis seedlings

在同一水質(zhì)條件下，毛竹幼苗苗高和葉片數(shù)以不通氧稍優(yōu)于通氧。在以自來水為水質(zhì)時，毛竹幼苗較高，但葉片數(shù)較少。在不通氧處理條件下，不同水質(zhì)處理間苗高和葉片數(shù)間無顯著性差異；在通氧處理條件下，不同水質(zhì)處理間苗高沒有顯著性差異，但無菌水中的葉片數(shù)顯著高于自來水。不通氧處理地上部分和地下部分鮮重及干重均稍高于通氧處理，但除自來水不通氧處理中的地下部鮮重和干重顯著高于通氧處理外，不同水質(zhì)通氧與否對幼苗地上、地下鮮重及干重無顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，對照條件下毛竹種子發(fā)芽率可以達到21.95%，經(jīng)過適當?shù)慕N、去皮、消毒處理，毛竹種子萌發(fā)率可以達到50%以上，與李偉成等［18］的研究結(jié)果相似。在相同條件下，浸種處理可使毛竹種子發(fā)芽率提高53.12%，這與前人的研究結(jié)論相似［19］。推測浸種處理可能使種皮透性增大，呼吸逐漸增強，促進萌發(fā)的物質(zhì)（尤其是GA3）含量升高，GA3經(jīng)胚釋放后轉(zhuǎn)移到糊粉層細胞，GA3可誘導(dǎo)α-淀粉酶、蛋白酶和其他水解酶的合成，加快種子貯藏物質(zhì)的降解，并能在一定程度上修復(fù)受到破壞的細胞膜，從而提高種子活力，從而誘導(dǎo)和促進種子萌發(fā)［20］。文獻［21-22］報道秋播毛竹種子發(fā)芽率為30% ～45%，春播種子發(fā)芽率為15% ～25%。同時李偉成等［18］研究表明竹類種子發(fā)芽一般要求20 ℃以上的氣溫或者最低萌發(fā)氣溫不能低于12.8 ℃，可能各區(qū)域?qū)嶒炛形h(huán)境差異較大，以及不同來源種子本身特性間有差異。

毛竹種子表面和胚乳中伴生著真菌［23］，毛竹種子萌發(fā)過程中，消毒是關(guān)鍵的一步。本研究結(jié)果表明，毛竹種子經(jīng)過10% NaClO 浸泡消毒20 min，播入蛭石中的發(fā)芽率達到61.76%，并徹底無污染。酒精是最常用的消毒劑，其穿透力和殺菌力都很強，但酒精一般和其他消毒劑聯(lián)合使用，促進其他消毒劑滲透到整個外植體表面，提高消毒效率［24］。有研究［25］表明NaClO 的消毒效果優(yōu)于其他幾種常用消毒劑（次氯酸鈣、升汞、溴水、過氧化氫、硝酸銀、抗生素），其滅菌的原理是次氯酸鈉溶液本身不太穩(wěn)定，水解后形成的次氯酸進一步分解后釋放出新生態(tài)氧，新生態(tài)氧的強氧化性可以殺死菌體。本研究結(jié)果中毛竹種子發(fā)芽率在剝皮和進行消毒處理下高于不進行消毒處理，雖然不同濃度NaClO 和消毒時間對毛竹的萌發(fā)率差異不顯著；試驗過程中發(fā)現(xiàn)，去皮種子的發(fā)芽時間比未去皮種子提早1 周左右，這與謝金蘭等［26］的研究結(jié)果一致，這可能是因為種皮中存在抑制萌發(fā)物質(zhì)或種皮的機械阻礙作用影響了種子的萌發(fā)。

根據(jù)已有文獻報道，毛竹種子多是在濾紙中（即種子消毒沖洗干凈后置于墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中）進行發(fā)芽［27］，普遍存在發(fā)芽率較低、污染嚴重的問題。發(fā)霉的種子外部會產(chǎn)生橘黃色、灰綠色或白色絲狀霉菌菌絲，胚根突破種皮后可能被霉菌感染而失去活力，而且霉菌容易擴散，會影響種子進一步萌發(fā)成苗，使其最終達不到發(fā)芽標準［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，切去種子的大部分胚乳，不僅能有效降低毛竹種子組織培養(yǎng)過程中的污染，而且不影響種子萌發(fā)，但種子胚乳量少，萌發(fā)的幼苗長勢普遍較弱［28］。本研究中，通過適當播前處理之后播種在蛭石中，能夠很好地解決萌發(fā)過程中的污染問題，而且顯著高于濕潤濾紙或紗布中播種的種子發(fā)芽率，不僅操作簡便，而且成苗質(zhì)量好，可以廣泛應(yīng)用于試驗研究中毛竹實生苗的培育或毛竹實生苗規(guī)模化生產(chǎn)。

本研究過程中，無論通氣與否，以自來水為水質(zhì)的毛竹水培體系污染率明顯高于雙濾水和無菌水，推測自來水中可能含有某些細菌，在高溫高濕的環(huán)境條件下病菌更易快速繁殖而侵染植物。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，通氧與否（經(jīng)過濾）對水培體系毛竹幼苗生長沒有明顯影響，這也與邵繼鋒［23］的研究結(jié)論相一致，推測可能原因是培養(yǎng)時間較短，植物對水氣的生長響應(yīng)差異還沒有體現(xiàn)出來，該機制有待進一步研究。

綜上所述，適當?shù)慕N、消毒等播前處理和播種方法能提高毛竹種子發(fā)芽率，且出苗整齊度高，幼苗長勢較好。水培培養(yǎng)中通入過濾后的氧氣，可以顯著降低毛竹幼苗的污染率，但水質(zhì)對毛竹幼苗生長無明顯的影響。本研究可為毛竹實生苗培育技術(shù)研究提供支持，但更完善的水培體系的建立，還需要進行進一步的研究。