普洱茶提取物對(duì)單純性肥胖大鼠MC4R基因表達(dá)的影響

易 娟，尹龍武，王 偉，彭鳳蘭

（長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，長沙 410000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人民的生活方式與膳食結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生改變，肥胖正以令人擔(dān)憂的速度逐年增加，日趨成為最嚴(yán)重的世界性健康問題之一。肥胖不僅被認(rèn)為是2型糖尿病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，而且嚴(yán)重影響心血管疾病的發(fā)生。超重和肥胖的人患上癌癥的概率比普通人顯著增高［1］。減肥可降低血壓和血脂水平，減少2型糖尿病的發(fā)病率，減少各種慢性疾病和急性不良事件的發(fā)生。

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)過后發(fā)酵形成的，包括長時(shí)間自然發(fā)酵和人工渥堆發(fā)酵。普洱茶中的化學(xué)活性物質(zhì)成分較綠茶等發(fā)生了較大變化，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等兒茶素含量低，而兒茶素等在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成大量高聚化合物——茶褐素［2］。普洱茶或茶褐素均具有改善肥胖、調(diào)節(jié)血脂等功效［3-6］。目前關(guān)于普洱茶抗肥胖的機(jī)制研究尚不明確。已有研究揭示其可能與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞合成和分化相關(guān)基因、脂肪代謝相關(guān)酶活、抑制脂肪細(xì)胞增殖和分化以及脂肪組織分泌的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子等有關(guān)，且近年來又發(fā)現(xiàn)茶多酚能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來調(diào)節(jié)肥胖［6-8］。目前普洱茶抗肥胖作用與食欲和能量調(diào)控中樞的關(guān)系這個(gè)研究領(lǐng)域稀缺［8］。黑皮素受體-4（melanocortin4 receptor，MC4R）作為神經(jīng)中樞重要調(diào)節(jié)因子之一，近年來備受關(guān)注［9］。MC4R激動(dòng)劑、瘦素類似物和脂肪酶抑制劑等一起被評(píng)估為較有前途的治療和預(yù)防肥胖的新靶點(diǎn)，這些藥物可能起著“飽腹信號(hào)”或者“拮抗食欲信號(hào)”等作用，可通過增加脂肪利用或降低脂肪吸收等調(diào)節(jié)肥胖［10］。但是，目前國內(nèi)外尚未見茶或茶多酚調(diào)節(jié)MC4R基因表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在觀察普洱茶提取物對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠MC4R的影響，進(jìn)而探討普洱茶提取物抗肥胖的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

普洱茶提取物的原材料來自云南紅河州哈尼古茶熟餅，由中南大學(xué)生命科學(xué)院茶與健康研究室分離提取，應(yīng)用高效液相色譜法和分光光度法分析普洱茶提取物中兒茶素及茶多酚含量（表1）。

表1 普洱茶提取物中茶多酚和兒茶素類含量Tab.1 Contents of tea polyphenols and catechins in Pu-erh tea extract

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)

30只雄性SD大鼠由湖南萊克斯景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體重90～100 g，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（ND組），高脂飼料組（HF組），普洱茶提取物干預(yù)組（PTE組）。正常對(duì)照組采用大鼠基礎(chǔ)飼料；高脂飼料組飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加10.0%豬油、1.0%膽固醇、10.0%蔗糖、0.5%脫氧膽酸鈉等；普洱茶提取物干預(yù)組飼料是在2 g普洱茶提取物中均勻混合100 g高脂飼料制成的。定期檢測(cè)大鼠體重（2次/周）。于3個(gè)月時(shí)，禁食12 h后，采靜脈血，生化檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC）、血甘油三酯（triglyceride，TG）、血低密度脂蛋白（low density lipoprotein-C，LDL-C）及血高密度脂蛋白（high density lipoprotein-C，HDL-C）等各項(xiàng)血脂水平（測(cè)試盒分別來自南京建成A111-1、A112-1、A113-1、A110-1）。麻醉處死大鼠后，取腸系膜、附睪等脂肪組織稱重，并留取附睪脂肪組織冷凍于液氮下用于mRNA檢測(cè)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)

1.3.1 組織樣品處理和RNA的提取

用液氮對(duì)干燥的研缽降溫；將附睪脂肪組織樣品放置于研缽內(nèi)，研磨組織至粉末狀。按照組織量加入TRlzon Reagent（CWBIO CW0580S），提取總RNA。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液聚集到管底。將對(duì)應(yīng)體積的dNTP Mix、Primer Mix、RNA Template混勻后，于70℃孵育10 min，再迅速冰浴2 min。再將對(duì)應(yīng)體積的5×RT Buffer、DTT、HiFiScript混勻后，于50℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，將其置于-80℃冰箱以防降解。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析肥胖相關(guān)基因MC4R的相對(duì)豐度。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 變性10 s， 58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。相關(guān)基因的引物信息見表2。

表2 PCR引物信息Tab.2 Oligonucleotide sequences for primers

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

用液氮將研缽預(yù)冷，取0.2 g附睪脂肪組織放入研缽中充分研磨，加蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒（CW0014S，康為世紀(jì)）對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。加入無水乙醇?jí)耗z，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，配制1乘電泳液，電泳，60 V壓縮蛋白（30 min），80 V分離蛋白（120 min），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)膜（300 mA恒流，2 h），封閉，一抗孵育過夜，Tris-HCl 緩沖液（Tris-buffered Saline Tween，TBST）反復(fù)洗膜，二抗孵育2 h，TBST反復(fù)洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯色后，進(jìn)行凝膠顯影成像。利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠脂肪組織中肥胖相關(guān)基因MC4R的蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間顯著性差異為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶提取物減肥降脂作用

2.1.1 普洱茶提取物對(duì)體重和體脂的影響

各組大鼠體重變化曲線如圖1所示，終末體重統(tǒng)計(jì)詳見表3。與正常對(duì)照組相比，高脂組大鼠的終末體重顯著增加，顯示高脂飲食誘導(dǎo)的單純性肥胖模型構(gòu)建成功。普洱茶提取物干預(yù)組大鼠的終末體重與高脂組相比顯著下降（P<0.05），與正常對(duì)照組相比略高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明普洱茶提取物能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠體重增加。

表3 各組大鼠體重、脂肪組織重量以及體脂比Tab.3 Body weight, adipose tissue weight and body fat ratio

圖1 大鼠體重變化圖Fig.1 Body weight gain of rats

高脂組大鼠附睪脂肪組織、腹膜脂肪重量以及體脂比與正常對(duì)照組相比均明顯增加，由此可見高脂模型構(gòu)建成功。普洱茶干預(yù)組大鼠附睪脂肪組織和腹膜脂肪重量以及體脂比，與高脂組相比顯著下降（P<0.05），與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試驗(yàn)表明，普洱茶提取物能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠體脂增加。以往的試驗(yàn)是多用茶水鼻飼法干預(yù)高脂肥胖大鼠，發(fā)現(xiàn)普洱茶具有減肥效應(yīng)［11-12］。本試驗(yàn)將普洱茶提取物混入高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，證實(shí)不同的攝入方式同樣可以達(dá)到減肥降脂的作用［4，13］。

2.1.2 普洱茶提取物對(duì)血脂水平的影響

與正常對(duì)照組相比，高脂組血清中TG、TC、LDL-C均顯著升高（P<0.05），HDL-C顯著降低（P<0.05）（表4）。與高脂組相比，普洱茶提取物干預(yù)組血脂水平降低，其中TC降低了34.5%，LDL-C降低了44.7%，HDL-C升高了56.8%，TG降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見普洱茶提取物能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂水平。結(jié)果表明，與肥胖模型組比較，普洱茶提取物能有效地抑制肥胖大鼠TG、TC、LDL-C等生化指標(biāo)，具有較好的降低血脂的作用［11-13］。

表4 生化檢測(cè)大鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C及TG含量Tab.4 Contents of TC, HDL-C, LDL-C and TG in rat serum unit: mmol·L–1

2.2 普洱茶提取物對(duì)肥胖因子MC4R mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，高脂組MC4RmRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，在普洱茶提取物干預(yù)組的表達(dá)卻顯著上調(diào)（P<0.05）。與高脂模型組相比，普洱茶提取物干預(yù)組脂肪組織中MC4RmRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）?？梢娖斩杼崛∥锬茱@著上調(diào)飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠中MC4RmRNA和蛋白的表達(dá)水平（圖2、3）。

圖2 普洱茶對(duì)高脂飲食導(dǎo)致肥胖大鼠中MC4R mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Pu-erh tea extracts on MC4R mRNA expression in adipose tissue of obesity rats induced by high-fat diet

3 討論

普洱茶在發(fā)酵過程中，茶多酚等化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成一種高聚化合物——茶褐素，它是普洱茶重要的活性物質(zhì)。有研究表明，普洱茶降血糖血脂等作用與其他茶類不同，可能與這種高聚化合物密切相關(guān)［5，10］。本試驗(yàn)是將普洱茶提取物混入高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其能有效地抑制高脂飲食試驗(yàn)動(dòng)物的體重和脂肪組織，并能降低TG、TC、LDL-C等血脂水平，具有良好的減肥降脂作用［4，11-14］。區(qū)別于茶水鼻飼法干預(yù)高脂肥胖大鼠，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的攝入方式同樣可以達(dá)到減肥降脂的作用。肥胖受多基因、多信號(hào)影響，有學(xué)者提出普洱茶減肥機(jī)制是否與中樞神經(jīng)信號(hào)因子相關(guān)［8］。本文觀察了普洱茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠中MC4R的影響，從而探討普洱茶抗肥胖機(jī)制。

圖3 普洱茶對(duì)高脂飲食導(dǎo)致肥胖大鼠中MC4R蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Pu-erh tea extracts onMC4R protein expressions in adipose tissue of obesity rats induced by high-fat diet

近年來較多研究證實(shí)MC4R與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)體重中起關(guān)鍵作用。作為重要的肥胖調(diào)節(jié)因子之一，MC4R是下丘腦分泌的一類肽類物質(zhì)，能通過中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)體重，可抑制食物攝入，調(diào)節(jié)瘦素、胰島素、血糖等，從而減低體重調(diào)節(jié)體脂［9］。動(dòng)物試驗(yàn)表明，敲除MC4R基因的小鼠表現(xiàn)出攝食過多等肥胖綜合癥［14］，而人類MC4R基因突變能導(dǎo)致青少年肥胖癥［15］。英國劍橋大學(xué)的學(xué)者2019年在Cell期刊上發(fā)表一項(xiàng)研究，對(duì)來自英國生物庫（UK Biobank）中的50萬人中鑒定出的61種MC4R基因變異型進(jìn)行了功能性描述，研究了它們與身體質(zhì)量指數(shù)和肥胖相關(guān)心血管代謝疾病之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)利用其中偏向β和arrestin招募的MC4R信號(hào)傳導(dǎo)可能成為治療肥胖及其相關(guān)心血管代謝疾病的有效策略［16］。下丘腦黑皮質(zhì)素神經(jīng)元的活性受到瘦素、饑餓激素、胰島素等這些外周激素的調(diào)節(jié)，這些外周信號(hào)分子可影響黑皮質(zhì)素神經(jīng)元活性而傳遞機(jī)體代謝信息［17］。2020年Ezzat等［18］發(fā)現(xiàn)，辣木籽提取物能控制高脂飲食肥胖大鼠血脂和體重，其降脂抗肥胖的作用機(jī)制與顯著上調(diào)MC4R和PPAR-α的mRNA基因（P< 0.01）表達(dá)有關(guān)。以往的高脂飲食動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，普洱茶能顯著降低游離脂肪酸FFA合成基因，增加PPAR-α及Leptin等脂肪合成和分化相關(guān)基因的表達(dá)［13，19］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶提取物能使高脂飲食誘導(dǎo)組大鼠脂肪組織中MC4R顯著上調(diào)。可見普洱茶提取物對(duì)飲食導(dǎo)致的單純性肥胖的減肥機(jī)制與普洱茶提取物能調(diào)節(jié)MC4R，從而影響能量代謝神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)脂肪代謝平衡有關(guān)，其作用機(jī)制是否與介導(dǎo)PPAR-α及Leptin等脂肪相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，需要更多試驗(yàn)深入研究。

普洱茶減肥降脂作用較為明顯，然而作用機(jī)制尚不明確。本文用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)觀察了普洱茶對(duì)與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠中MC4R基因的影響，結(jié)果表明普洱茶提取物能明顯上調(diào)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠中MC4R基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果提示，普洱茶減肥作用可能與中樞調(diào)節(jié)脂肪代謝平衡的重要因子MC4R有關(guān)。然而普洱茶活性物質(zhì)復(fù)雜且不穩(wěn)定，其機(jī)制是否與普洱茶中主要活性物質(zhì)茶褐素有關(guān)，還需多方面多角度深入探討。此外，富含活性物質(zhì)EGCG的綠茶和富含茶黃素的紅茶等其他茶類抗肥胖作用是否與調(diào)節(jié)MC4R有關(guān)，也值得更多的試驗(yàn)探討。