多指標(biāo)綜合評分結(jié)合正交試驗(yàn)法優(yōu)選大鼠對乙酰氨基酚肝損傷模型

李紫元 ， 龍小鈴 ， 陳彩萍 ， 劉逸雷 ， 梁偉燊 ， 劉俊丹 ，邱文才 ， 倫健熾 ， 唐陸平 ， 何永明

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 ， 廣東 佛山 528000)

對乙酰氨基酚又名撲熱息痛(APAP)、醋氨酚，是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥。治療劑量的APAP有效、安全，但大劑量用藥時(shí)會(huì)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人造成肝損傷甚至肝衰竭[1-2]。目前，采用對乙酰氨基酚制作的肝損傷模型應(yīng)用廣泛，但是并沒有一個(gè)穩(wěn)定的造模方法，使得造模效果有較大差異[3-4]。本試驗(yàn)旨在探究給藥劑量、染毒途徑和采血時(shí)間等因素對APAP造成大鼠肝損傷模型效果的影響，為制作藥源性急性肝損傷模型優(yōu)化出最佳的條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(170±20) g，雌雄各半，合格證號：SCXK(粵)2013-0002；高壓滅菌全價(jià)顆粒飼料；動(dòng)物和飼料由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物室，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～70%。 每天12 h日光燈照明。墊料為消毒玉米芯。適應(yīng)性飼喂3 d，挑選體重均勻的100只用于試驗(yàn)。

1.2 供試品和試劑 對乙酰氨基酚，購自河北冀衡(集團(tuán))藥業(yè)有限公司，批號：71610195；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT，批號：16111503)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(谷草轉(zhuǎn)氨酶AST，批號：16063002)，均購自南京建成生物工程研究所；堿性磷酸酶(ALP，批號：H-170301)、總蛋白(TP，批號：Z-1601131)、白蛋白(ALB，批號：Z-160809)、總膽紅素(TBIL，批號：A-171028)、直接膽紅素(DBIL，批號：A-161120)等，均購自北京利德曼生化股份有限公司。

1.3 主要儀器 AU2700全自動(dòng)生化分析儀，購自美國Backman公司；Leica組織切片機(jī)，購自上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；KD-BM生物組織包埋機(jī)、KD-T生物組織攤靠片機(jī)，均購自浙江省金華市科邊儀器設(shè)備有限公司；G&G-JJ500電子天平，購自常熟雙杰測試儀器廠。

1.4 正交設(shè)計(jì) 以APAP染毒劑量、染毒途徑、采血時(shí)間為3個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，按照L9(34)正交表安排試驗(yàn)，因素和處理見表1和表3。APAP用40 ℃蒸餾水配制，大鼠分別以灌胃(ig)、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc)方式染毒，染毒后4、16 h和28 h用乙醚誘導(dǎo)麻醉，后腔靜脈采血，分離血清用于生化檢測(生化項(xiàng)目委托佛山市南海區(qū)第五人民醫(yī)院檢測)。取出肝臟，稱量，計(jì)算肝系數(shù)。取相同部位肝臟用4%甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

表1 APAP致大鼠肝損傷正交因素水平表Table 1 Orthogonal test of liver damage induced by APAP in rats

1.5 肝損傷綜合評價(jià) 對乙酰氨基酚一般引起肝實(shí)質(zhì)性細(xì)胞壞死，使得丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、直接膽紅素(DBIL)和總膽紅素(TBIL)均會(huì)有顯著升高，并且使肝臟腫大[5-6]，根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)在篩選條件中的主次賦予加比權(quán)重：ALT和AST為0.4 U/L；DBIL和TBIL為0.2 μmol/L；肝系數(shù)0.02；其他各項(xiàng)指標(biāo)和為0.1。由此計(jì)算肝損傷的綜合評價(jià)指標(biāo)X。X=(ALT/ALTmax + AST/ASTmax)×0.4+(DBIL/DBILmax+TBIL/TBILmax)×0.2+肝系數(shù)/肝系數(shù)max×0.02+其他指標(biāo)/其他指標(biāo)max×0.1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel表格收集整理數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。資料先進(jìn)行一般描述性分析，計(jì)算各計(jì)量資料的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性采用單因素方差分析；非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。性別統(tǒng)計(jì)分析組間差異采用t值分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠APAP致肝損傷的生化檢測 結(jié)果見表2。肝系數(shù)(Liver coefficient，LC)第3組最高，各試驗(yàn)組顯著高于對照組(P<0.05)。ALT第3組最高，各試驗(yàn)組顯著高于對照組(P<0.05)。AST第3組最高，第1、2、3、4、6、8、9組顯著高于對照組(P<0.05)。堿性磷酸酶各試驗(yàn)組與對照組間差異不具有顯著性(P>0.05)。DBIL第2、3組最高，第2、3、4、5組顯著高于對照組(P<0.05)。TBIL第4組最高，第1、2、3、4、9組顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 APAP致大鼠肝損傷L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果 (續(xù)表)Table 2 L9 (34) orthogonal test results of liver injury induced by APAP in rats(continued)

表2 APAP致大鼠肝損傷L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 2 L9 (34) orthogonal test results of liver injury induced by APAP in rats

2.2 大鼠APAP致肝損傷綜合評價(jià) 結(jié)果見表3。第3號結(jié)果最好，正交試驗(yàn)優(yōu)選出的造模條件為A1B3C3。

表3 正交試驗(yàn)安排與優(yōu)化結(jié)果Table 3 Orthogonal test arrangement optimization results

2.3 大鼠APAP致肝損傷生化項(xiàng)目不同性別比較 結(jié)果見表4。ALT、DBIL、TBIL和ALP這4個(gè)肝損傷主要的生化指標(biāo)，公鼠均大于母鼠且差異顯著(P<0.05)。5′-核苷酸酶(5′-NU)、白蛋白(ALB)、膽堿酯酶(CHE)和總蛋白(TP)這4項(xiàng)指標(biāo)，母鼠大于公鼠且差異顯著(P<0.05)。肝系數(shù)(LC)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和腺苷脫氨酶(ADA)3個(gè)指標(biāo)，公、母大鼠差異不顯著(P>0.05)。

表4 APAP致大鼠肝損傷性別比較Table 4 Gender comparison of APAP induced liver injury in rats

2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 結(jié)果見中插彩版圖1。不同劑量、不同時(shí)間和不同的中毒途徑均出現(xiàn)了明顯的肝細(xì)胞空泡變性和肝細(xì)胞壞死等病變。

綜合以上結(jié)果， 800 mg/(kg·bw) APAP經(jīng)腹腔注射雄鼠，28 h后可得大鼠肝損傷最佳模型。

3 討論

對乙酰氨基酚(APAP)是肝損傷的常用造模藥物。其造成肝損傷的機(jī)制是APAP通過細(xì)胞色素P450代謝成為N-乙?；?對-苯醌亞胺(N-acetyl-para-benzoquinone imine，NAPQI)，其會(huì)導(dǎo)致急性肝小葉中央型壞死，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)會(huì)與其結(jié)合消除毒性。當(dāng)GSH耗盡時(shí)，NAPQI會(huì)發(fā)揮其肝毒性作用并與蛋白質(zhì)巰基相結(jié)合為APAP蛋白質(zhì)加合物，此加合物會(huì)傳播和放大肝毒性[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠APAP染毒致肝損傷造模劑量在200～1 000 mg/(kg·bw) 不等[9]。在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究表明，口服給藥后在1～2 h內(nèi)會(huì)到達(dá)血藥濃度最高峰，T1/2 ka和T1/2 kb分別在0.2～0.5 h和3.5～4.5 h[10]。肝損傷模型的主要染毒方式為灌胃(ig)、腹腔注射(ip)和皮下注射(sc)[11]，皮下注射時(shí)藥物主要是通過局部的毛細(xì)血管和淋巴管吸收而進(jìn)入體內(nèi)造成肝損傷，腹腔注射則是藥物可以通過大量的毛細(xì)血管和淋巴管吸收進(jìn)入體內(nèi)，而灌胃主要通過胃腸吸收到達(dá)體內(nèi)，而小腸黏膜具有豐富的絨毛并且血流量較大，故急性肝損傷造模效果優(yōu)于皮下給藥[12]。

依據(jù)以上的3個(gè)條件選出染毒劑量、染毒方式和采血時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果顯示，9組試驗(yàn)均對大鼠造成不同程度的肝損傷，但以上3個(gè)條件對肝損傷的影響均不顯著。從數(shù)據(jù)篩選可以得出以800 mg/(kg·bw)腹腔注射APAP、28 h后能得到最佳的肝損傷模型。在造模劑量上與前人研究較為符合，隨著給藥劑量的增大，造模效果越好；腹腔給藥造模效果優(yōu)于口腔灌胃，而且操作便捷，故選擇腹腔注射；在模型形成的時(shí)間上，可知APAP并未隨著其血藥濃度而損傷肝臟，推測由于APAP并不直接損傷肝臟，而是調(diào)控細(xì)胞色素P450代謝而損傷肝臟，故存在一定的延時(shí)性。

性別對肝損傷模型也有較大影響。已有研究表明，APAP急性肝損傷的性別差異存在于成年小鼠，具體表現(xiàn)為成年雄性小鼠比成年雌性小鼠肝臟損傷更明顯。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠公鼠在肝損傷主要指標(biāo)上高于母鼠且差異顯著，對APAP的敏感性高，造模效果優(yōu)于母鼠。其機(jī)制可能與成年雄性鼠肝臟抗氧化代謝酶活性比成年雌鼠低，繼而導(dǎo)致肝損傷加重。母鼠在5′-核苷酸酶、白蛋白、膽堿酯酶、總蛋白這4個(gè)指標(biāo)中高于公鼠，雖然對肝損傷判定有一定指導(dǎo)意義，但不是肝損傷的主要生化指標(biāo)。所以在APAP肝損傷模型性別選擇上盡量用公鼠，也可以因試驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的性別。

意外的是，試驗(yàn)組中白蛋白和總蛋白較對照組有顯著的增高，與肝損傷的表現(xiàn)不同[13]，懷疑與血漿濃縮或腎功能損害有關(guān)，需要繼續(xù)研究。

此試驗(yàn)為藥物性肝損傷優(yōu)選出了最佳的造模條件，并為藥物性肝損傷的藥理藥效學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。