重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)檢測伯氏疏螺旋體方法的建立

馬曉菁 ， 謝彩云 ， 劉麗婭 ， 葉 鋒 ， 谷文喜 ， 鐘 旗 ， 易新萍

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 ， 新疆 烏魯木齊 830011)

伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi,B.burgdorferi)屬螺旋體科(Spirochaetaceae)疏螺旋體屬(Borrelia),是萊姆病(Lyme disease)的病原體。萊姆病呈世界性分布，主要通過攜帶病原體的蜱蟲叮咬傳播，至少有30多個國家報告有萊姆病的存在，且發(fā)病區(qū)域和發(fā)病率呈上升趨勢[1]。我國于1986—1987年在黑龍江省海林縣首次從病原學(xué)上證實萊姆病的存在[2]。全國已經(jīng)有19個省、市、自治區(qū)確定存在萊姆病的自然疫源地[3]。目前我國萊姆病新發(fā)病例高達(dá)2萬余例,且發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢[4]。萊姆病主要的診斷方法包括病原體檢測、免疫學(xué)檢測以及分子生物技術(shù)檢測。其中伯氏疏螺旋體的獲得為萊姆病的診斷提供確鑿證據(jù)，但在臨床樣本中伯氏疏螺旋體數(shù)目稀少，且培養(yǎng)周期較長，使其檢測在臨床中應(yīng)用受到限制[5]。同時由于伯氏疏螺旋體抗原成分的復(fù)雜性，以及各亞種之間存在抗原差異，使得萊姆病的免疫學(xué)診斷受到了挑戰(zhàn)[6]。萊姆病分子水平的檢測主要以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，巢氏PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)較為廣泛的應(yīng)用于伯氏疏螺旋體的檢測[7-8]。重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增(Recombinase aided amplification,RAA)技術(shù)，利用來自于大腸桿菌的 recA 重組酶替代PCR高溫解鏈，在單鏈 DNA 結(jié)合酶(Single-stranded DNA binding，SSB)和DNA聚合酶的共同作用下使DNA 片段在體外快速地擴增[9]。與常規(guī)的PCR技術(shù)相比，RAA技術(shù)不需要專業(yè)的PCR儀，反應(yīng)溫度低，反應(yīng)速度快。本研究選取伯氏疏螺旋體16S rRNA基因保守序列設(shè)計引物，采用RAA技術(shù)電泳法，旨在為伯氏疏螺旋體檢測提供了一種簡便、快速的手段。

1 材料與方法

1.1 菌株 伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC35210)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC1531)、沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC3762)、鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株(DSM21-537)，均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；DNA marker，購自北京莊盟國際生物基因有限公司；RAA 核酸擴增試劑盒(電泳法)，購自江蘇奇天基因生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取 按照TIANamp Bactieria DNA Kid說明書分別提取伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株以及鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)伯氏疏螺旋體16S rRNA基因保守序列設(shè)計并合成特異性RAA引物，見表1，引物由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 伯氏疏螺旋體RAA(電泳法)引物Table 1 RAA(electrophoresis assay) primers of Borrelia burgdorferi

1.5 RAA擴增體系及條件 在1.5 mL離心管中配制反應(yīng)體系(表2)，溶液渦旋混勻并離心，將混合好的上述溶液加入到裝有凍干粉的基礎(chǔ)反應(yīng)單元反應(yīng)管中，向每個反應(yīng)管中加入2.5 μL乙酸鎂溶液并混合均勻。將反應(yīng)管放置在37 ℃水浴40 min，反應(yīng)結(jié)束后，每個反應(yīng)管中加入50 μL酚/氯仿(1∶1)，震蕩混勻，12 000 r/min離心1 min，取10 μL上層溶液進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

表2 RAA(電泳法)擴增體系Table 2 The amplification system of RAA(electrophoresis assay)

1.6 RAA特異性 分別以伯氏疏螺旋體B31、大腸桿菌、沙門菌以及鉤端螺旋體基因組DNA為模板，按照RAA試劑盒配制反應(yīng)體系，37 ℃水浴40 min。 反應(yīng)結(jié)束后，每個反應(yīng)管中加入50 μL酚/氯仿(1∶1)，震蕩混勻，12 000 r/min離心1 min，取10 μL上層溶液進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.7 RAA敏感性 10倍系列稀釋1 ng/μL伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31基因組DNA，分別以濃度為1、0.1、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL和10-7ng/μL伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31基因組DNA為模板，按照RAA試劑盒配制反應(yīng)體系，37 ℃水浴40 min。反應(yīng)結(jié)束后，每個反應(yīng)管中加入50 μL酚/氯仿(1∶1)，震蕩混勻，12 000 r/min 離心1 min，取10 μL上層溶液進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RAA特異性分析 以伯氏疏螺旋體B31、大腸桿菌、沙門菌及鉤端螺旋體基因組DNA為模板，RAA產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。結(jié)果可見，陽性質(zhì)控品擴增出419 bp目的片段，伯氏疏螺旋體B31獲得152 bp條帶，與目的片段一致，大腸桿菌、沙門菌以及鉤端螺旋體均未擴增出目的條帶(圖1)，表明該方法具有良好的特異性。

圖1 伯氏疏螺旋體RAA特異性結(jié)果Fig.1 The specificity results of Borrelia burgdorferi by RAAM:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2 000; 1：鉤端螺旋體基因組DNA(DSM21537)； 2：RAA陽性質(zhì)控品; 3：伯氏疏螺旋體B31基因組DNA; 4：大腸桿菌基因組DNA(CVCC1531)M:DNA marker DL2 000； 1:Genomic DNA of Leptospira(DSM21537); 2:Positive quality control of RAA; 3: B31Genomic DNA of Borrelia burgdorferi; 4:Genomic DNA of E.coli(CVCC1531)

2.2 RAA敏感性確定 將1 ng/μL伯氏疏螺旋體B31基因組DNA 10倍系列稀釋，RAA產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。結(jié)果可見，濃度為0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、1pg/μL和0.1pg/μL可擴增出與目的片段一致的條帶，其余稀釋度未擴增出目的條帶(圖2)，伯氏疏螺旋體RAA電泳法最低檢出模板DNA濃度為100 fg/μL。

圖2 伯氏疏螺旋體RAA敏感性結(jié)果Fig.2 The sensitivity results of Borrelia burgdorferi by RAAM:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2 000; 1:伯氏疏螺旋體B31基因組DNA；2：0.01 pg/μL伯氏疏螺旋體B31基因組DNA； 3：0.1 pg/μL伯氏疏螺旋體B31基因組DNA； 4：1 pg/μL伯氏疏螺旋體B31基因組DNA； 5：RAA陽性質(zhì)控品M:DNA marker DL2 000; 1: B31 genomic DNA of Borrelia burgdorferi； 2:0.01 pg/μL B31 genomic DNA of Borrelia burgdorferi; 3:0.1 pg/μL B31 genomic DNA of Borrelia burgdorferi; 4:1 pg/μL B31 genomic DNA of Borrelia burgdorferi; 5:Positive quality control of RAA

3 討論

萊姆病是伯氏疏螺旋體引起的一種人獸自然疫源性人獸共患病。人感染萊姆病嚴(yán)重者可造成終生殘疾，甚至死亡[10]。動物被攜帶病原體的蜱蟲叮咬后，可出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大、腦炎等一系列臨床癥狀。因此，萊姆病不僅對人類公共安全造成危害，也嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展。從不同樣本中分離得到伯氏疏螺旋體，為萊姆病確診提供有力證據(jù)。但伯氏疏螺旋體分離培養(yǎng)耗時、陽性率低，因此臨床診斷應(yīng)用較少。目前萊姆病免疫學(xué)檢測常用方法包括間接免疫熒光(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)以及免疫印跡和免疫酶染色法等。但IFA只能檢測到菌體表面蛋白，因此靈敏度和特異性較低，易造成假陽性或假陰性，已逐步被酶聯(lián)免疫試驗代替。ELISA方法雖廣泛應(yīng)用于萊姆病的檢測，但抗原存在變異，且全細(xì)胞抗原缺乏種族特異性[11]，降低了該方法的特異性，易誤診。免疫印跡法具有較高的特異性，但操作復(fù)雜[12]。

隨著聚合鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)不斷完善，伯氏疏螺旋體分子水平的檢測主要以PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，該方法具有敏感、特異以及操作簡便等優(yōu)點，但是核酸的擴增依賴不斷變化的溫度，需要專業(yè)的儀器，限制了該方法在基層推廣以及現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代起無需熱變性的核酸恒溫擴增技術(shù)不斷發(fā)展，其中重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增(RAA)技術(shù)是近年來常溫核酸擴增的創(chuàng)新技術(shù)，該技術(shù)采用recA重組酶與DNA緊密結(jié)合，并與引物形成聚合體掃描雙鏈DNA，在與引物同源的序列處使雙鏈DNA解旋，在SSB和DNA聚合酶共同作用下，新的DNA片段可以在體外快速地擴增出來[11]。RAA引物設(shè)計簡單，擴增過程不需要高溫解旋DNA，目的片段可在短時間內(nèi)獲得指數(shù)級積累。目前RAA技術(shù)應(yīng)用廣泛，張小平等[13]利用RAA技術(shù)建立沙門菌快速檢測方法；周冬根等[14]建立中東呼吸綜合征冠狀病毒RAA檢測方法。

本研究以伯氏疏螺旋體16S rRNA基因保守序列設(shè)計RAA引物，等溫擴增僅伯氏疏螺旋體獲得目的片段，該方法具有良好的特異性。在對不同濃度伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31基因組DNA擴增后，最小檢出濃度為100 fg/μL。該方法的建立與傳統(tǒng)的PCR方法相比具有較好的特異性以及敏感性，擴增過程不需要PCR儀，且反應(yīng)時間大大縮短。為今后萊姆病快速診斷提供一種簡便、可靠的手段。