耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子特征研究

王金波，李海英，張亞妮，孫 敏

寶雞市人民醫(yī)院檢驗科，陜西寶雞 721000

金黃色葡萄球菌作為臨床感染中最常見的革蘭陽性球菌，主要引起皮膚、泌尿道、呼吸道等部位感染，特別是隨著高強(qiáng)度抗菌藥物的使用、頻繁的侵入性操作和多部位靜脈通道的開放，金黃色葡萄球菌院內(nèi)感染率和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢出率呈上升趨勢[1-2]。MRSA菌株的耐藥產(chǎn)生主要原因是mecA基因等的獲得，使金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，它干擾了金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的親和力進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性[3-4]。本研究使用多位點序列分型(MLST)對金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型及耐藥機(jī)制分析，MLST分型使用的是7個MRSA管家基因的獨特等位基因譜，MRSA菌株經(jīng)過普通擴(kuò)增測序后確定序列類型，如果其中6個MRSA的管家基因相同則為同一克隆復(fù)合體[5]，對不同分子類型和克隆復(fù)合體的菌株進(jìn)行耐藥性分析、毒力特征分析和耐藥機(jī)制研究成為本研究的重點，以期為本地區(qū)的MRSA研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本地區(qū)兩家大型三甲醫(yī)院自2018年1月至2019年12月臨床分離的MRSA菌株共124株。院內(nèi)MRSA感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]：入院48 h后發(fā)生的MRSA感染，排除社區(qū)獲得性MRSA感染，排除重復(fù)分離菌株等，本次標(biāo)本的收集獲得患者或者家屬的口頭同意。

1.2儀器與試劑 使用布魯克公司的質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)(MALDI-TOF MS)及其配套試劑進(jìn)行細(xì)菌鑒定，使用ABI公司的聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，使用上海天能公司的電泳儀進(jìn)行擴(kuò)增后的產(chǎn)物初步鑒定，使用天根生物公司的PCR試劑盒和細(xì)菌DNA提取試劑，使用Oxoid公司的全套藥敏紙片。人工設(shè)計細(xì)菌的耐藥基因與毒力基因的擴(kuò)增引物，并委托華大基因進(jìn)行引物合成，引物序列根據(jù)Primer5.0軟件設(shè)計并在Pubmed網(wǎng)站中進(jìn)行引物BLAST。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25923和ATCC43300)購自原衛(wèi)生部臨床檢驗中心。葡萄瓊脂平板(MH)平板和哥倫比亞血平板購買自迪景公司。

1.3菌株分離與鑒定方法 菌株從臨床標(biāo)本中進(jìn)行初步分離，并經(jīng)過布魯克質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，使用標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏試驗，藥敏結(jié)果根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2020年版(CLSI-2020)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。MRSA的判定方法為頭孢西丁判定法，即在0.5麥?zhǔn)蠞岫扰囵B(yǎng)16 h后的抑菌圈直徑≤21 mm，則判定為MRSA菌株，使用細(xì)菌凍存管保存菌株。

1.4基因擴(kuò)增

1.4.1菌株DNA的提取 將收集的MRSA菌株保存管解凍，使用接種環(huán)挑取少量的菌懸液三區(qū)劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板，挑取3個MRSA菌株的菌落溶于含溶菌酶的核酸溶解溶液中，混勻后37 ℃消化30 min，然后100 ℃15 min，隨之高速離心12 000 r/min 10 min，取上清液即為細(xì)菌DNA基因組，-20 ℃冰箱保存。

1.4.2基因擴(kuò)增體系與條件 使用細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行耐藥和毒力基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25.0 μL，其中包括2倍濃度的預(yù)混溶液12.5 μL，Taq酶1.0 μL，前向和反向引物各1.0 μL，細(xì)菌DNA模版1.0 μL，滅菌的去離子水補足總體系，震蕩混勻和離心沉淀后上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[4]。擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1.5%凝膠電泳，確定基因陽性菌株，電泳條件為110 V，5 min，以擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μL和1.0 μL的上樣緩沖液混勻后上樣，以陽性耐藥和抗毒力基因作為陽性對照，以無DNA模版作為陰性對照，通過紫外線觀察擴(kuò)增產(chǎn)物并記錄結(jié)果。

1.4.3基因檢測 按照MLST擴(kuò)增常用引物及條件擴(kuò)增7個MRSA的管家基因，分別是arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL，產(chǎn)物送華大基因測序并在MLST官網(wǎng)進(jìn)行比對，獲得序列類型并確定克隆復(fù)合體，單個位點如果出現(xiàn)不同則判定為單位點變異體。檢測耐藥基因的攜帶情況，包括耐β-內(nèi)酰胺酶類基因mecA、耐四環(huán)素基因tetM、耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ、耐大環(huán)內(nèi)酯類基因erm A和erm C，以及耐消毒劑基因qacA/B；同時檢測毒力基因攜帶情況，包括纖連蛋白結(jié)合蛋白基因(fnbA和fnbB)、溶血素基因(hla和hlb)、腸毒素基因(sec和seh)、殺白細(xì)胞素基因(PVL)。見表1。

表1 PCR引物序列與產(chǎn)物長度

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用WHONET5.0軟件對124株MRSA菌株進(jìn)行耐藥性分析，數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0軟件，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較使用χ2檢驗或者Fish確切概率法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MRSA菌株患者的臨床特征及MRSA菌株科室分布 2018年1月至2019年12月臨床分離的MRSA菌株共124株，其中菌株來自創(chuàng)面等分泌物標(biāo)本50株，痰液、灌洗液標(biāo)本27株，尿液等標(biāo)本31株，胸腔積液等無菌體液標(biāo)本7株，血液標(biāo)本等9株。MRSA菌株患者年齡3 d至97歲，但以65歲以上老年人[68株(54.8%)]為主。性別分布以男性[75株(60.5%)]為主。124株MRSA的科室分布以呼吸內(nèi)科[40株(32.3%)]、神經(jīng)內(nèi)科[31株(25.0%)]和內(nèi)分泌科[24株(19.4%)]為主。

2.2院內(nèi)感染的MRSA的MLST結(jié)果分析 124株MRSA菌株經(jīng)過測序比對，共得到MLST分型15種，屬于12個克隆復(fù)合體，其中克隆復(fù)合體59中的序列類型59分型的菌株[79株(63.7%)]為主要流行群，見表2。還有4株MRSA無法完成序列類型的鑒定，可能是未知分型。

表2 醫(yī)院感染的MRSA的MLST分型結(jié)果分析

2.3MRSA和序列類型59菌株的藥敏結(jié)果分析 對124株MRSA進(jìn)行藥敏結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)其對青霉素G、苯唑西林、紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率均較高，對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性亦處在較高水平，但是對利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧和奎奴普丁/達(dá)托霉素均100%敏感，有1株對呋喃妥因耐藥，需引起警惕。根據(jù)序列類型結(jié)果，分為序列類型59菌株和非序列類型59菌株，序列類型59的MRSA對克林霉素具有更高的耐藥率，較非序列類型59的MRSA明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 MRSA、序列類型59、非序列類型59菌株的藥敏結(jié)果分析

續(xù)表3 MRSA、序列類型59、非序列類型59菌株的藥敏結(jié)果分析

2.4MRSA和序列類型59菌株的耐藥基因結(jié)果 對124株MRSA進(jìn)行耐藥基因的分析，發(fā)現(xiàn)有4株菌株耐β-內(nèi)酰胺酶類基因mecA為陰性，攜帶率96.8%。有11株MRSA對四環(huán)素耐藥，但是tetM為陰性，攜帶率51.6%。有13株MRSA同時攜帶耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ。有16株MRSA同時攜帶耐大環(huán)內(nèi)酯類基因erm A和erm C。對124株MRSA進(jìn)行序列類型59和非序列類型59的耐藥性分析，序列類型59和非序列類型59的4類耐藥基因攜帶率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但是在耐消毒劑基因的比較中，序列類型59的克隆株耐消毒劑基因的攜帶率明顯高于非序列類型59的克隆株耐消毒劑基因的攜帶率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 MRSA、序列類型59、非序列類型59菌株的耐藥基因結(jié)果

2.5MRSA和序列類型59菌株的毒力基因結(jié)果 序列類型59和非序列類型59菌株在毒力基因纖連蛋白結(jié)合蛋白基因、溶血素基因和腸毒素基因攜帶率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；序列類型59的克隆株P(guān)VL攜帶率明顯高于非序列類型59的克隆株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 MRSA、序列類型59、非序列類型59菌株的毒力基因結(jié)果

3 討 論

隨著MRSA分子分型方法的廣泛使用，MRSA克隆株的相關(guān)研究越來越多地受到研究者的關(guān)注，其主要原因是相同克隆株在進(jìn)化源上相似性更高，遺傳背景更加接近，可能具有更加一致的耐藥機(jī)制和毒理特征[6]。本研究回顧性的分析了MRSA在本地區(qū)的分子分型特點和克隆復(fù)合體59的耐藥基因和毒力基因的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)的院內(nèi)感染MRSA主要為克隆復(fù)合體59(序列類型59)克隆株，這與之前研究報道結(jié)果存在差異[5]。有研究報道，克隆復(fù)合體59也是社區(qū)獲得性MRSA的主要分布類型[2]，從本研究結(jié)果可以看出，MRSA已經(jīng)出現(xiàn)雙向擴(kuò)散可能，即醫(yī)院向社區(qū)入侵，社區(qū)向醫(yī)院滲透，但是克隆復(fù)合體59克隆群的社區(qū)和醫(yī)院的流行情況，仍然需要進(jìn)一步的觀察研究，特別是需要即時快速檢測，同時也需要對MRSA分型分布進(jìn)行長時間監(jiān)測。此外，在本研究中有4株MRSA的MLST分型未知，這說明新的MLST分型可能出現(xiàn)，存在暴發(fā)流行的可能，更新MLST分型和監(jiān)測其變化趨勢具有潛在的重要臨床意義。

序列類型是一種常見的基因分型方法，常用來研究菌株之間的傳播途徑和進(jìn)化關(guān)系[7]。本研究結(jié)果顯示，序列類型59的MRSA菌株在本院流行的主要原因可能為耐消毒劑基因的攜帶率更高。有研究報道，在世界范圍內(nèi)MLST分型的結(jié)果具有明顯的差異性[7]。在北美地區(qū)MRSA的分子分型主要是序列類型8，雖然與歐洲地區(qū)的菌株具有明顯的相似進(jìn)化關(guān)系，但是在英國的MRSA主要流行株為序列類型22和序列類型36，這與美國地區(qū)的MRSA分子分型具有明顯的差異[8]。亞洲地區(qū)MRSA分子分型亦表現(xiàn)出明顯的差異性[9-14]。

在本研究中，MRSA對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率均高于60%，這提示紅霉素和克林霉素的臨床使用已經(jīng)受到極大地限制。此外，對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率亦超過30%，特別是對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率超過40%，這提示尿路感染患者的用藥應(yīng)該酌情考慮減少喹諾酮類藥物的使用，呋喃妥因可能是一個更好的選擇[4]。雖然糖肽類等抗菌藥物的敏感率為100%，但是由于其相對分子質(zhì)量較大，藥物體內(nèi)分布受到極大限制，皮膚和關(guān)節(jié)等部位的MRSA感染治療效果較差[15-16]。此外，序列類型59菌株的克林霉素耐藥率更高，提示該類菌株的耐藥機(jī)制可能更加復(fù)雜，遠(yuǎn)期耐藥情況更加嚴(yán)峻。本研究發(fā)現(xiàn)，有4株菌株耐β-內(nèi)酰胺酶類基因mecA為陰性，但是對該類抗菌藥物耐藥，這提示存在其他的耐藥機(jī)制，如青霉素結(jié)合蛋白再修飾等[3]。有11株菌株對四環(huán)素耐藥，但是相關(guān)耐藥基因tetM為陰性，這提示其他的外排基因參與了四環(huán)素耐藥[17]。對于2種耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ的檢測和2種耐大環(huán)內(nèi)酯類基因erm A和erm C的檢測，發(fā)現(xiàn)同一株菌株可以同時攜帶兩種耐藥基因，這提示MRSA菌株的耐藥機(jī)制可能非常復(fù)雜，需要更加深入的研究[16]。

對耐消毒劑基因的檢測發(fā)現(xiàn)，54.8%的MRSA菌株攜帶qac A/B基因，該基因能夠使MRSA菌株在苯扎溴銨等消毒劑的作用下仍存活，這些應(yīng)當(dāng)引起院感監(jiān)測部門和臨床醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注。特別是在序列類型59克隆株中，耐消毒劑基因qac A/B的攜帶率更高，這提示該類菌株可能具有更強(qiáng)的存活能力和潛在的流行風(fēng)險。中性粒細(xì)胞是血液中含量最多的非特異性免疫細(xì)胞，其對多種細(xì)菌均有殺傷作用，但是MRSA產(chǎn)生的PVL能夠引起中性粒細(xì)胞的損傷和細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致機(jī)體膿腫和MRSA的全身擴(kuò)散[18-19]。序列類型59克隆株的PVL攜帶率高達(dá)72.2%，這提示該類菌株具有明顯的全身播散傾向和潛在的膿腫擴(kuò)大趨勢，因而在臨床治療中，應(yīng)該積極進(jìn)行感染灶的引流和沖洗，減少播散可能。

綜上所述，院內(nèi)感染MRSA的分子分型以序列類型59克隆株為主，其克林霉素耐藥率更高，消毒劑抗性更強(qiáng)，白細(xì)胞毒性更加明顯，具有潛在的廣泛播散風(fēng)險，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)研究者的重視和思考。