乳腺癌患者外周血白細(xì)胞中P53、PTEN、c-Myc表達(dá)及其臨床意義*

黃光成，鐘曉武,,，姚麗華，徐 磊，馬 強(qiáng),，鄒 江，孫 茹，郭曉蘭，，△

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川南充 637000

乳腺癌的發(fā)病率和致死人數(shù)遠(yuǎn)高于其他女性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性生命健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的有關(guān)全球癌癥狀況的最新數(shù)據(jù)顯示：2018年全年約有210萬(wàn)乳腺癌新增病例，約占女性腫瘤總新增病例25%，乳腺癌僅次于肺癌已成為全球第二大常見(jiàn)癌癥[1]。早期發(fā)現(xiàn)和有效的治療監(jiān)測(cè)是乳腺癌的治療關(guān)鍵[2-3]。探索一種能在乳腺癌產(chǎn)生早期就能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)診斷，甚至在乳腺癌發(fā)生前的良性病變階段就能預(yù)測(cè)和預(yù)警乳腺癌發(fā)生概率的檢測(cè)指標(biāo)和方法，對(duì)于降低乳腺癌的發(fā)生率和致死率具有極為重要的科學(xué)意義。基于目前腫瘤診治過(guò)程中對(duì)于腫瘤早期診斷及實(shí)體腫瘤手術(shù)切除后的治療監(jiān)測(cè)中所遭遇的困境，本研究探索性引入新興的腫瘤檢測(cè)方法“液體活檢”[4]，以外周血白細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，研究乳腺癌患者外周血白細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因P53、PTEN、c-Myc的表達(dá)情況，以期發(fā)揮液體活檢在腫瘤疾病診治中的優(yōu)勢(shì)，為乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療檢測(cè)探討新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年11月至2015年12月于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者作為研究對(duì)象，其中乳腺癌105例(乳腺癌組)，年齡為29～62歲，中位年齡46歲，良性乳腺疾病107例(良性乳腺疾病組)，包括乳腺良性腫瘤40例、乳腺腺病38例和乳腺炎29例患者，年齡為17～57歲，中位年齡41歲。以上病例均按照2012年WHO乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)由病理活檢確診[5]，排除其他腫瘤疾病及慢性疾病，且均為首次確診及治療，對(duì)照組為本院體檢健康女性共92例，年齡為28～58歲，中位年齡43歲，均排除腫瘤疾病及其他慢性疾病。

1.2儀器與試劑 NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(Thermo scientific)、BIO-RAD T100TMThermal Cycler PCR儀、Roche LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，USA)；P53、PTEN、c-Myc、β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Random primer、Oligo(dT)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒采用Roche的FastStart Essential DNA Green Master。

1.3方法

1.3.1抗凝外周血采集和Trizol法提取總RNA 分別采集研究對(duì)象4 mL抗凝外周靜脈血，3 800 r/min離心5 min留取血細(xì)胞，溶血?jiǎng)┤苎笥昧姿猁}緩沖溶液清洗3次去除紅細(xì)胞碎片和血紅蛋白。將白細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol，然后按照廠家提供說(shuō)明書提取總RNA，提取完成后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，并用Nanodrop 2000c 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照每25 μL逆轉(zhuǎn)錄體系包含1.8 μg RNA和200 U M-MLV Reverse Transcriptase在BIO-RAD上將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄完成后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒FastStart Essential DNA Green Master，按照10 μL體系中含0.5 μL cDNA在Roche LightCycler?96上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。P53、PTEN、c-Myc、β-actin引物序列參照文獻(xiàn)[6-8]。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組外周血白細(xì)胞中PTEN、P53、c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 乳腺癌組和良性乳腺疾病組中PTEN和P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；良性乳腺疾病組P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于乳腺癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組外周血白細(xì)胞中PTEN、P53、c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2乳腺癌組外周血白細(xì)胞中的P53、PTEN、c-Myc mRNA 相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者外周血白細(xì)胞中PTEN mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳腺癌組TNM 0+Ⅰ+Ⅱ期患者外周血白細(xì)胞中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于TNM Ⅲ+Ⅳ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 乳腺癌組外周血白細(xì)胞中的P53、PTEN、c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3良性乳腺疾病組外周血白細(xì)胞中c-Myc mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 良性乳腺疾病組的乳腺炎患者外周血白細(xì)胞中c-Myc mRNA 相對(duì)表達(dá)水平低于乳腺良性腫瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 良性乳腺疾病組外周血白細(xì)胞中P53、PTEN、c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因參與、多步驟協(xié)同作用的過(guò)程，癌基因的激活、抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生過(guò)程中有重要意義。P53、PTEN、c-Myc分別是與腫瘤相關(guān)的重要的抑癌和促癌基因，在腫瘤組織中三者常出現(xiàn)明顯的表達(dá)異常或者突變，是參與調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥的關(guān)鍵基因[9-11]。而人體的免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥產(chǎn)生中都扮演了關(guān)鍵的角色[12-13]。免疫細(xì)胞在發(fā)揮腫瘤免疫作用時(shí)，除了接受免疫系統(tǒng)自身調(diào)控，還會(huì)直接或間接受到來(lái)自腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的影響。具體表現(xiàn)為不同組織來(lái)源和腫瘤基因背景的腫瘤，其腫瘤免疫過(guò)程中所參與的主要免疫細(xì)胞成分及免疫細(xì)胞功能存在明顯差異，并伴隨免疫細(xì)胞相關(guān)基因差異表達(dá)[14-15]。而且腫瘤患者在血液和腫瘤組織間存在免疫細(xì)胞、免疫效應(yīng)分子和免疫調(diào)控分子的交換[16]。因此，腫瘤患者血液中的免疫細(xì)胞或直接來(lái)源于腫瘤組織，或受腫瘤組織產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子和免疫調(diào)控分子影響可能出現(xiàn)某些基因表達(dá)的改變。

本研究探索性地對(duì)304例外周血白細(xì)胞標(biāo)本中的P53、PTEN、c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。既往研究顯示，免疫細(xì)胞中抗腫瘤基因P53和PTEN可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化成熟和功能狀態(tài)，以及各種細(xì)胞因子合成和分泌來(lái)發(fā)揮免疫監(jiān)視、抗腫瘤免疫及維持免疫穩(wěn)態(tài)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組和良性乳腺疾病組中PTEN和P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示乳腺癌患者外周血白細(xì)胞中抗腫瘤基因P53和PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平的下降可能參與構(gòu)成了人體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤免疫的功能失調(diào)。推測(cè)白細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的P53和PTEN導(dǎo)致免疫細(xì)胞免疫監(jiān)視作用削弱而參與了腫瘤的發(fā)生，或者在腫瘤發(fā)生后受腫瘤組織所釋放免疫調(diào)控分子的調(diào)控，出現(xiàn)P53和PTEN表達(dá)降低。結(jié)合臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，PTEN的下調(diào)程度與是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其臨床病理分期存在一定關(guān)聯(lián)，提示外周血白細(xì)胞中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)程度具有預(yù)警乳腺癌發(fā)生及乳腺癌是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛能。另外，本研究包含了107例良性乳腺疾病患者外周血白細(xì)胞標(biāo)本，研究結(jié)果提示良性乳腺疾病患者外周血白細(xì)胞中部分腫瘤相關(guān)基因發(fā)生改變。因此，通過(guò)對(duì)良性乳腺疾病患者進(jìn)行腫瘤相關(guān)基因篩查，同時(shí)結(jié)合特定的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可能成為一種預(yù)測(cè)乳腺癌發(fā)生的有效手段。

綜上所述，乳腺癌患者外周血白細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因P53、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降對(duì)乳腺腫瘤的存在有良好的提示作用。這種出現(xiàn)于腫瘤患者中異于健康人群的免疫細(xì)胞的基因表達(dá)變化有可能成為一種用于腫瘤診治和預(yù)防的新的突破口。而且相對(duì)于病理組織，外周血白細(xì)胞作為臨床檢測(cè)標(biāo)本在腫瘤的診斷和治療監(jiān)測(cè)中具有侵襲力低、易定期反復(fù)獲取等優(yōu)勢(shì)。由于血液標(biāo)本成分均一，能有效消除因腫瘤組織異質(zhì)性所造成的病理檢測(cè)結(jié)果差異，且利于患者在實(shí)體腫瘤切除后的治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷[18]。因此，利用外周血白細(xì)胞進(jìn)行液體活檢是一種潛在的腫瘤檢查手段。