miR-124與HLA-G在宮頸癌中的表達(dá)及變化研究

陶國(guó)華，謝 瑋，李 荔

南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001

宮頸癌為女性高發(fā)的婦科疾病，根據(jù)我國(guó)婦科腫瘤流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，2017年以來宮頸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵誘因，屬于基因病毒，能夠快速增殖和復(fù)制[2]。微小RNAs(microRNAs)是一種小分子的非編碼RNA，能夠通過對(duì)DNA片段進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高細(xì)胞的生物活性。miR-124屬于microRNAs中的一種，有研究證實(shí)其在肺癌中活性降低，在不同惡性腫瘤中表達(dá)也有所差異，miR-124在乳腺癌中通過低表達(dá)介導(dǎo)SP1信號(hào)改變癌細(xì)胞活性[3]。人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)是機(jī)體重要的免疫耐受分子，隨著對(duì)HLA-G研究深入，人們推測(cè)HLA-G與惡性腫瘤免疫逃竄具有相關(guān)性[4]。本研究旨在探討miR-124與HLA-G在宮頸癌中的表達(dá)及變化，為臨床宮頸癌的診斷提供相關(guān)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年1月本院住院治療的65例宮頸癌患者作為研究組，年齡28～75歲，中位年齡47歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果確診為宮頸癌；(2)接受術(shù)后切除或淋巴掃除治療；(3)未接受化學(xué)治療；(4)信息齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)全身感染；(3)接受化學(xué)治療；(4)合并重要器官病變。另選取同期在本院進(jìn)行子宮肌瘤切除的40例患者作為對(duì)照組，年齡25～70歲，中位年齡46歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。兩組患者和家屬均了解本研究?jī)?nèi)容，且簽署知情同意書，本研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平 將兩組患者宮頸組織常規(guī)石蠟包埋、脫蠟、水化處理后加入購(gòu)自中國(guó)深圳子科生物的Trizol試劑進(jìn)行RNA提取，氯仿溶解。采用購(gòu)自中國(guó)上海昂拉儀器的超微量分光光度計(jì)計(jì)算RNA純度，吸光度A280參考范圍為0.0～2.0，在上述范圍為符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。采用武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 6 min，98 ℃ 28 s，72 ℃ 30 s，80 ℃ 4 min，總計(jì)40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平。見表1。

表1 引物序列

1.3化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)血清HLA-G水平 分別抽取兩組患者空腹8 h靜脈血4 mL，4 000 r/min離心5 min后，利用美國(guó)雅培公司生產(chǎn)的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血清HLA-G水平，研究步驟如下：按照儀器說明書制備單抗復(fù)合物，采用辣根過氧化物結(jié)合到固定的載體上，將兩組血清及上述復(fù)合物加入鏈霉親和素孔板中，37.7 ℃培養(yǎng)1 h，磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗，加入底物，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)HLA-G表達(dá)水平(波長(zhǎng)為425 nm)，檢測(cè)范圍：0.5～300.0 ng/mL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskai-Wallis秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度等指標(biāo)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組與研究組miR-124相對(duì)表達(dá)水平和HLA-G水平比較 研究組宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，研究組血清HLA-G水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組miR-124相對(duì)表達(dá)水平和HLA-G水平比較[M(P25,P75)]

2.2研究組不同臨床病理指標(biāo)的miR-124相對(duì)表達(dá)水平、HLA-G水平比較 研究組宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平在國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺體浸潤(rùn)及脈管浸潤(rùn)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而血清HLA-G水平在FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 研究組不同臨床病理指標(biāo)的miR-124相對(duì)表達(dá)水平、HLA-G水平比較[M(P25,P75)]

續(xù)表3 研究組不同臨床病理指標(biāo)的miR-124相對(duì)表達(dá)水平、HLA-G水平比較[M(P25,P75)]

2.3miR-124、HLA-G診斷宮頸癌的ROC曲線分析 miR-124+HLA-G聯(lián)合檢測(cè)診斷宮頸癌的靈敏度、特異度、AUC均高于miR-124及HLA-G單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果。見表4、圖1。

表4 miR-124、HLA-G及兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值分析

圖1 miR-124、HLA-G診斷宮頸癌的ROC曲線分析

3 討 論

宮頸癌產(chǎn)生及發(fā)展是一個(gè)多環(huán)境、多因素的過程。近些年，隨著分子領(lǐng)域研究不斷深入，大量miRNA對(duì)多種惡性疾病例如乳腺癌、卵巢癌等具有重要作用[5]。HLA-G分子為機(jī)體重要的免疫因子，最初被發(fā)現(xiàn)具有參與母-胎界面免疫耐受作用，減少排斥反應(yīng)。

有研究報(bào)道，宮頸癌發(fā)展過程中存在大量microRNAs異常表達(dá)，其中miR-21能夠加快宮頸癌生物活性，與miR-466表達(dá)相似，而miR-320能夠保護(hù)宮頸組織，減少癌細(xì)胞惡性侵襲，通過調(diào)節(jié)FOXM1基因發(fā)揮作用[6]。熊興東等[7]研究報(bào)道，宮頸癌組織中microRNA-124呈低表達(dá)趨勢(shì)且與癌細(xì)胞過度增殖、凋亡不足、侵襲性生長(zhǎng)密切相關(guān)。王夢(mèng)潔等[8]研究報(bào)道，宮頸癌組織中miR-124水平低于健康宮頸組織，提示miR-124低表達(dá)能夠加快癌癥病變。HLA-G是一種生物活性廣泛的免疫指標(biāo)，其水平升高與Fas受體活化相關(guān)，有研究報(bào)道，F(xiàn)as大量活化能夠加快T淋巴細(xì)胞凋亡，改變多種細(xì)胞抗原提呈能力，加快惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃竄[9]。張欣等[10]研究報(bào)道，宮頸癌患者血清HLA-G水平高于健康人群。本研究顯示，研究組宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，研究組血清中HLA-G水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與LI等[10]研究報(bào)道結(jié)果相似。

miR-124通過介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)活性相關(guān)，能夠加快癌細(xì)胞深層浸潤(rùn)[11]。有研究報(bào)道，miR-124能夠通過升高PDCD6水平，激活有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,從而促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移及遷移[12]。本研究顯示，研究組宮頸組織中miR-124相對(duì)表達(dá)水平在FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺體浸潤(rùn)及脈管浸潤(rùn)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而血清HLA-G水平在FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示HLA-G水平越高，宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越快，疾病FIGO分期越高，加快疾病發(fā)展。高水平HLA-G能夠減弱自然殺傷細(xì)胞功能，減少對(duì)宮頸癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用[13]。冷雪嬌等[14]研究報(bào)道，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者血清HLA-G升高，說明高水平HLA-G能夠加快宮頸癌癌變。本研究miR-124和HLA-G靈敏度較高，ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-124聯(lián)合HLA-G對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值，提示miR-124、HLA-G能夠?qū)m頸癌診斷提供較高的準(zhǔn)確率。王夢(mèng)潔等[15]研究指出，通過ROC曲線了解到miR-124能夠增加診斷宮頸癌的準(zhǔn)確性。

綜上所述，miR-124與HLA-G水平變化與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)有關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)有望成為宮頸癌診斷的新靶點(diǎn)。