龍須菜血紅素加氧酶138位亮氨酸突變對藻紅膽素合成的影響?

李 瑞， 黃小云， 臧曉南， 尚孟慧， 畢 瑩， 徐曉婷

(中國海洋大學(xué)海洋生命科學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)屬于紅藻門(Rhodophyta)，江蘺目 (Gracilariales)，江蘺科(Gracilariaceae)，是一種生長極其迅速的大型經(jīng)濟海藻[1]，藻體瓊脂含量高達16%～28%，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域都具有廣泛應(yīng)用[2-3]。

(Gracilaria salicornia(YP_009019632.1)，Schizymenia dubyi (YP_009295967.1)，Sebdenia flabellata(YP_009296171.1)，Schimmelmannia schousboei(YP_009295765.1)，Rhodymenia pseudopalmata(YP_009293614.1)，Chondrus crispus(YP_007627407.1)。圖中方框(Ⅰ～Ⅵ)表示保守結(jié)構(gòu)域，深色區(qū)域為保守氨基酸。箭頭所指為HO(M) 的突變位點。The box (Ⅰ～Ⅵ) in theFigure represents the conserved domain, and the dark region is the conserved amino acid. The arrow indicates the mutation site of HO(M).)

藻紅蛋白(Phycoerythrin)是龍須菜中主要的藻膽蛋白，其位于藻膽體外圍，能直接吸收光能，進而作為天線色素參與光合作用。而且，藻紅蛋白是天然色素，可作為天然著色劑、營養(yǎng)保健劑等廣泛應(yīng)用于食品及營養(yǎng)研究領(lǐng)域[4-7]。藻紅蛋白還因為具有熒光特性，常用作免疫化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中的熒光標簽[8-10]。天然藻紅蛋白的熒光發(fā)射特征峰約在580 nm左右[11]，其熒光發(fā)色團為開鏈的四吡咯結(jié)構(gòu)[12]，熒光發(fā)色團包括藻紅膽素(Phycoerythrobilin，PEB)[13]和藻尿膽素(Phycourobilin，PUB)2種[14]。一般認為藻尿膽素的功能是傳遞能量[15]，直接發(fā)射熒光的是藻紅膽素。藻紅膽素通過與脫輔基藻紅蛋白上的半胱氨酸Cys結(jié)合使藻紅蛋白表現(xiàn)出光學(xué)特性。

藻紅膽素的合成起始于血紅素，血紅素加氧酶(Heme oxygenase, HO)將血紅素氧化成第一個中間代謝產(chǎn)物——膽綠素(BV)IXα，該步驟為藻紅膽素合成的限速步驟[16]。鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶(FDRBs)可作用于膽綠素(BV)IXα的特殊位點將其還原為藻紅膽素[17-19]。(BV)IXα被還原為藻紅膽素有兩種代謝途徑，第一種是PebS催化一個四電子還原反應(yīng)直接將(BV)IXα轉(zhuǎn)化成3Z-PEB；第二個途徑分兩步：首先(BV)IXα在PebA的催化下獲得雙電子被還原為15,16-DHBV；然后15,16-DHBV在PebB的催化下再獲得兩個電子，轉(zhuǎn)化為3Z-PEB[20-22]。藻紅膽素的合成是形成有光學(xué)活性藻紅蛋白的重要環(huán)節(jié)，而血紅素加氧酶是催化血紅素降解為膽綠素這一限速步驟的關(guān)鍵酶類[23]，在藻紅膽素的合成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

近年來關(guān)于藻紅蛋白的研究報道越來越多，但大部分集中于天然藻紅蛋白的分離純化及脫輔基蛋白亞基的功能研究及表達[24-27]，對于藻紅膽素合成元件的來源及合成途徑的研究多集中于藍藻[28-29]，而對于紅藻的研究較少。本實驗室前期獲得了龍須菜中的血紅素加氧酶基因ho-1(GenBank accession number: MH025903)[30]，本研究在對ho-1基因序列進行分析后，預(yù)測了血紅素(Heme)的結(jié)合位點，為了進一步驗證這些位點對藻紅膽素合成的作用，我們擬選取其中一個位點進行點突變，而且為了研究該突變在藻紅膽素合成的兩條途徑中的作用，我們將突變后的ho(M)基因分別與pebS和pebB/pebA組合表達，為藻紅蛋白的重組表達奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 龍須菜RNA的提取和cDNA的合成

使用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Plant RNA Kit, CAT NO: R6827, America)提取龍須菜RNA，將龍須菜RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。置于-20 ℃環(huán)境下保存。

1.2 藻紅膽素血紅素加氧化酶基因ho-1的克隆

根據(jù)本實驗室前期獲得的龍須菜血紅素加氧酶ho-1(GenBank accession number: MH025903)的序列，設(shè)計引物：

F1GGATCCATGTCTACTAATTTAGCTCAACA

R1GAGCTCTTAAGTAAATTTTTTTCGCAAACTAC

下劃線所標出的序列分別為限制性酶切位點BamH I和SacI。

以龍須菜cDNA為模板，以F1和R1為引物擴增得到ho-1的序列，連接T載體獲得pEASY-T1-ho-1。

測序驗證序列的準確性，并對序列進行分析。應(yīng)用DNAMAN[31]軟件預(yù)測基因所對應(yīng)的氨基酸序列；運用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件分析蛋白質(zhì)基本性質(zhì)，推導(dǎo)預(yù)測其分子量；通過BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對氨基酸序列進行同源性比對分析；依據(jù)同源序列，應(yīng)用DNAMAN進行多重序列比對獲得氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)和保守氨基酸；應(yīng)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[32]對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行分析，預(yù)測可能的關(guān)鍵活性位點。

1.3 ho-1基因的點突變

根據(jù)活性位點的預(yù)測和序列分析結(jié)果，我們預(yù)測第413位堿基對應(yīng)的氨基酸位點可能為血紅素的關(guān)鍵結(jié)合位點，因此根據(jù)ho-1的序列，采用定點突變的方式，在ho-1基因中進行了一個堿基突變，將第413位堿基由T突變成C，為方便后續(xù)研究該基因稱作ho(M)；設(shè)計定點突變引物，擴增得到ho(M)基因。

根據(jù)ho(M)的突變位點及ho-1的序列，設(shè)計引物：

ho(M)-F1CAAAAAAAATTGCACAAACAGCTATGAATTT

ho(M)-R1 AAATTTGACCTCCCGATAAGTCACCCA

下劃線所標出的位點為定點突變的位點。

以pEASY-T1-ho-1的序列為模板，擴增得到線性化的pEASY-T1-ho(M)的序列。利用Blunting Kination Ligation(BKL)Kit (TaKaRa, Code No. 6127A) 自連獲得質(zhì)粒pEASY-T1-ho(M)。

1.4 表達載體pET-ho-1、pET-ho-1-pebS、pET-ho-1-pebA-pebB、pET-ho(M)、pET-ho(M)-pebS、pET-ho(M)-pebA-pebB的構(gòu)建

需要構(gòu)建的表達載體如表1所示。pebS和pebA(GenBank:MH715937)-pebB(GenBank: MH725905)[33]片段均為本實驗室前期從龍須菜中克隆得到的，且已構(gòu)建了克隆載體pEASY-T1-pebS和pEASY-T1-pebA-pebB，它們將由血紅素加氧酶HO催化合成的膽綠素通過兩個途徑分別合成藻紅膽素。

表1 構(gòu)建的工程菌株與重組質(zhì)粒

pEASY-T1-ho-1和pEASY-T1-ho(M) 經(jīng)BamHI和SacI雙酶切后，將ho-1和ho(M)基因片段分別插入pET-24a多克隆位點，連接得到表達載體pET-ho-1以及pET-ho(M)。將pEASY-T1-pebA-pebB、pET-ho-1和pET-ho(M) 載體分別經(jīng)SacI和XhoI雙酶切后獲得pebA-pebB片段和酶切后的載體，將pebA-pebB片段插入酶切后的兩個載體中，得到pET-ho-1-pebA-pebB和pET-ho(M)-pebA-pebB。以成功構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-ho-1-pebA-pebB和pET-ho(M)-pebA-pebB為基礎(chǔ)，將pEASY-T1-pebS經(jīng)SacI和XhoI雙酶切后把pebS插入pET-ho-1-pebA-pebB和pET-ho(M)-pebA-pebB中替代pebA-pebB基因片段，從而得到表達載體pET-ho-1-pebS和pET-ho(M)-pebS。

分別取pET-ho-1、pET-ho-1-pebS、pET-ho-1-pebA-pebB，pET-ho(M)、pET-ho(M)-pebS、pET-ho(M)-pebA-pebB質(zhì)粒0.5 μL，將其加入50 μL大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化得到表達菌株E.coliph、E.coliphS、E.coliphAB、E.coliph(M)、E.coliph(M)S和E.coliph(M)AB。

1.5 重組菌株的誘導(dǎo)表達

將E.coliph、E.coliphS、E.coliphAB、E.coliph(M)、E.coliph(M)S 和E.coliph(M)AB以及空白對照E.coliBL21菌種分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)E.coliph、E.coliphS、E.coliphAB、E.coliph(M)、E.coliph(M)S和E.coliph(M)AB的培養(yǎng)基中加入5 μL濃度為100 mg/mL的硫酸卡那霉素，空白對照E.coliBL21的培養(yǎng)基不加抗生素。在37 ℃，200 r/min條件下，培養(yǎng)12 h，活化所有菌液，然后將菌液轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下擴大培養(yǎng)2～3 h后，向擴大培養(yǎng)后的重組菌液中分別加入濃度為1 mol/L的IPTG至終濃度為0.1 mmol/L。在28 ℃，200 r/min誘導(dǎo)時間為12 h的條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達。

1.6 重組菌株的蛋白電泳檢測

分別取誘導(dǎo)表達后的E.coliph、E.coliphS、E.coliphAB、E.coliph(M)、E.coliph(M)S和E.coliph(M)AB以及空白對照E.coliBL21七個全菌菌液2 mL，10 000 r/min離心1 min，棄上清，用200 μL濃度為0.01 mol/L的PBS重懸菌體沉淀，加入50 μL 5×Loading Buffer混合，于100 ℃沸水中煮沸5 min，進行SDS-PAGE檢測，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%，上樣量為20 μL，電壓170 V，電泳時間約為1 h。

1.7 重組菌株的熒光發(fā)射光譜檢測

收集誘導(dǎo)后的菌體沉淀，用0.9%的生理鹽水洗滌菌體沉淀兩次，加入3 mL濃度0.01 mol/L的PBS重懸菌體沉淀，使用超聲破碎儀超聲破碎6 min，破碎5 s間隔2.5 s；離心取上清液使用HITACHIFI-4600型熒光光譜儀進行熒光發(fā)射光譜分析。熒光光譜掃描速度1 200 nm/min，藻紅蛋白檢測時激發(fā)波長為420 nm，狹縫寬度5.0 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 ho-1和ho(M)基因的克隆與序列分析

以龍須菜cDNA為模板，擴增得到一段長度約700 bp的條帶，測序結(jié)果顯示其實際大小為696 bp，與序列MH025903一致，確定其為ho-1基因。

用DNAMAN軟件分析ho-1基因序列，cDNA編碼框序列長693 bp，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。ho-1基因開放閱讀框編碼231個氨基酸，其中含有107個非極性氨基酸(A、V、L、I、F、W、Y、M、P)，69個極性氨基酸(G、N、Q、S、T、C)，23個酸性氨基酸(D、E)和32個堿性氨基酸(K、H、R)。ExPASy預(yù)測HO-1分子量為26.3 kDa，等電點為9.30。

突變序列ho(M)只在第413位堿基由T突變成C，其他位置ho-1和ho(M) 的序列完全一致(見圖1)。

圖1 ho-1、ho(M)的cDNA核酸序列比對圖

多序列比對顯示龍須菜的血紅素加氧酶HO-1的氨基酸序列與其他藻類的同源序列比對的相似性為85.77%，說明血紅素加氧酶HO-1在藻類中比較保守。其氨基酸序列存在6個保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，如圖2所示，分別是MSTNLAQ，LREGTTK，HSMAENVSFVKSFLGGVVD，ANLFFVY，NQPELLIAHAYTRYMGDLSGGQILKKIA，F(xiàn)QELNSN；以及多個保守氨基酸殘基，其中位于115～142位的結(jié)構(gòu)域保守性最強，推測其在保持血紅素氧化酶的功能上具有重要作用。

對ho-1序列預(yù)測獲得的氨基酸序列進行BlastP分析結(jié)果顯示，其屬于HemeO superfamily超級家族且氨基酸序列上存在17個可能的血紅素(Heme)結(jié)合位點(見圖3)，分別是R10、H17、A20、E21、V26、L30、Y125、T126、R127、S133、G134、L138、K169、R173、F197、N200、F204。118～145位存在一段HemeO保守結(jié)構(gòu)域的扭結(jié)螺旋結(jié)構(gòu)。推測這些位點能夠與血紅素結(jié)合，進而催化血紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素，發(fā)揮血紅素氧化酶的功能。

(▲所示為可能的血紅素(Heme)結(jié)合位點。118～145位長條顯示為一段HemeO保守結(jié)構(gòu)域的扭結(jié)螺旋結(jié)構(gòu)。Possible heme binding sites are shown as ▲. The 118～145 band shows a spiral structure in the HemeO conservative domain. )

利用SWISS-MODEL對HO-1的三級結(jié)構(gòu)進行分析，參照集胞藻Synechocystissp. PCC6803的血紅素氧化酶heme oxygenase-1的結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖4所示，HO-1內(nèi)部會形成一個血紅素結(jié)合口袋(見圖4A)，有18個可能的活性位點與Heme連接(見圖4B)，包括R10、H17、A20、V26、L30、Y125、T126、M129、G130、S133、G134、I137、L138、K169、R173、F197、N200、F204。其中有15個位點R10、H17、A20、V26、L30、Y125、T126、S133、G134、L138、K169、R173、F197、N200、F204與BlastP預(yù)測的血紅素結(jié)合位點一致。

(A.預(yù)測的HO-1的三維結(jié)構(gòu)圖，其中HEM為血紅素，L138為138位亮氨酸；B.預(yù)測的血紅素與HO-1的連接，其中箭頭所示為L138與血紅素的連接。A. 3D-structure diagram of predicted HO-1, where HEM is heme and L138 is leucine at position 138； B. Predicted heme to HO-1 linkage, where arrow indicates L138 to heme linkage.)

本研究引入的突變位于ho-1基因的第413位，由堿基T突變成C，對應(yīng)編碼的第138位氨基酸由亮氨酸(L，非極性氨基酸)突變?yōu)榻z氨酸(S，極性氨基酸)。該位點經(jīng)BlastP和SWISS-MODEL兩種程序都預(yù)測是血紅素的結(jié)合位點，其位于118～145位HemeO保守結(jié)構(gòu)域的扭結(jié)螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)，而且該位點還在115～142位的高度保守的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，因此接下來我們通過重組表達和熒光活性觀察來確定該位點在藻紅膽素合成中的作用。

2.2 HO-1和HO(M)蛋白的重組表達

將重組菌株E.coliph、E.coliph(M)、E.coliphS、E.coliph(M)S、E.coliphAB及E.coliph(M)AB經(jīng)誘導(dǎo)表達后進行蛋白電泳檢測，均在25～30 kDa間檢測到蛋白條帶，與HO-1蛋白預(yù)測的大小26.3 kDa一致，而空白對照沒有此蛋白條帶，表明HO-1蛋白及其突變蛋白HO(M)都可以在大腸桿菌E.coli中正常表達(見圖5)。

2.3 重組表達菌株的熒光發(fā)射光譜分析

圖6A為空白對照E.coliBL21與重組菌株E.coliph及E.coliph(M)的熒光發(fā)射光譜圖，重組菌株E.coliph在595 nm附近檢測到微弱的熒光峰，該位置近似于藻紅膽素的熒光特征峰；而E.coliph(M)及E.coliBL21均未檢測到該特征峰，初步表明ho-1基因的第413位堿基突變后，其催化膽綠素合成的功能受到影響。

(泳道1為Marker (14～100 kD)，泳道2～7分別為E. coli ph、E. coli ph(M)、E. coli phS、E. coli ph(M)S、E. coli phAB及E. coli ph(M)AB；泳道8為空白對照E. coli BL21，箭頭表示HO-1和HO(M) 蛋白。Lane 1 is Marker (14～100 kD), lane 2～7 are respectively E. coli ph, E. coli ph(M), E. coli phS, E. coli ph(M)S, E. coli phAB, E. coli ph(M)AB. Lane 8 is the blank control E. coli BL21.The arrows represent HO-1 and HO(M) proteins.)

在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究重組菌株E.coliphS、E.coliph(M)S、E.coliphAB及E.coliph(M)AB的熒光活性(見圖6B、C)，發(fā)現(xiàn)重組菌株E.coliphS和E.coliphAB在595 nm附近有明顯的藻紅膽素的熒光特征峰，表明HO-1能夠催化血紅素合成膽綠素，膽綠素在鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶PebA和PebB或者PebS兩條途徑下都可以催化合成藻紅膽素；而在突變后的E.coliph(M)S及E.coliph(M)AB與E.coliph(M)及空白對照E.coliBL21一樣無任何熒光峰出現(xiàn)，進一步表明ho(M)由堿基T突變成C的第413位堿基位點十分關(guān)鍵，其對應(yīng)編碼的第138位亮氨酸對于酶的活性至關(guān)重要，該位點的突變使得PebS和PebB/A兩條催化途徑均無法合成藻紅膽素，直接影響藻紅膽素的合成。

比較重組菌株E.coliph、E.coliphS、E.coliphAB的熒光峰值(見圖6D)可見，E.coliph的熒光峰值略低于E.coliphS、E.coliphAB，可能是因為在HO-1的作用下，只能由血紅素合成膽綠素，沒有完整的藻紅膽素合成，因而熒光值較低；在重組菌株E.coliphS、E.coliphAB中，于630 nm處也檢測到微弱的熒光峰，推測此熒光峰可能是由在藻紅膽素合成過程中所生成的一些中間體產(chǎn)生的。

3 討論

對于藻類血紅素加氧酶的研究始于單細胞紅藻Cyanidiumcaldarium[34-35], 研究發(fā)現(xiàn)，該藻類中的血紅素加氧酶是由核基因編碼，在細胞質(zhì)核糖體上合成的可溶性酶；在紅藻C.caldarium的提取物中已經(jīng)檢測到將原血紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素IXα和將膽綠素IXα轉(zhuǎn)化為藻紅膽素及藻藍膽素的酶反應(yīng)，并對其進行了表征[23, 36-40]。之后，Reith等[41]構(gòu)建了紅藻紫菜Porphyrapurpurea葉綠體基因組高分辨率基因圖譜，并從中獲得了編碼血紅素加氧酶的基因pbsA，這是首次在葉綠體基因組上檢測到該基因。1996年，在藍藻集胞藻Synechocystissp. PCC6803菌株中鑒定出兩個不同的血紅素加氧酶基因，命名為ho[42]；后來，在其提取物中檢測到了藻膽素生物合成的反應(yīng)，這是體外血紅素加氧酶活性和原核細胞提取物中膽綠素IX向藻膽素轉(zhuǎn)化的首次報道[43]。1998年，在大腸桿菌中克隆并表達了來自集胞藻PCC6803的ho1，在其細胞提取物中產(chǎn)生血紅素加氧酶活性[44]。隨后，Glazer 和 Tooley 等[45]將集胞藻Synechocystissp. PCC6803的藻藍蛋白合成相關(guān)基因 (cpcA,cpcE,cpcF,hox1,pcyA) 導(dǎo)入大腸桿菌表達細胞中，成功實現(xiàn)了具有光學(xué)活性藻藍蛋白α亞基的合成。

本研究以龍須菜作為材料，對克隆得到的龍須菜血紅素加氧酶ho-1基因的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其第138位氨基酸經(jīng)BlastP和SWISS-MODEL兩個軟件都預(yù)測是血紅素的結(jié)合位點，其位于118～145位HemeO保守結(jié)構(gòu)域的扭結(jié)螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)，而且該位點還在115～142位的高度保守的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。為了驗證該位點的功能，本研究對ho-1基因內(nèi)的413位堿基由T突變?yōu)镃，對應(yīng)的138位氨基酸由亮氨酸(L，非極性氨基酸)突變?yōu)榻z氨酸(S，極性氨基酸)，然后構(gòu)建ho-1及其突變基因ho(M)的異源重組表達菌株，并在誘導(dǎo)溫度28 ℃，IPTG工作濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時間為12 h的條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達；蛋白電泳結(jié)果顯示相關(guān)重組表達蛋白已正常表達。熒光發(fā)射光譜顯示，重組菌株E.coliphAB和E.coliphS在595 nm處可以檢測到熒光發(fā)射峰，表明已生成具有正常光學(xué)活性的藻紅膽素，即HO-1能夠正常催化血紅素合成膽綠素，且合成的膽綠素可以再由兩條途徑合成藻紅膽素，一條是由鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶PebS直接催化合成PEB；第二條是由鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶PebA和 PebB依次催化合成 PEB。而突變菌株E.coliph(M)、E.coliph(M)S、E.coliph(M)AB與E.coliBL21一樣無任何特征峰出現(xiàn)，表明由于ho(M) 第413位堿基位點的突變，使得血紅素加氧酶HO失活，不能夠合成膽綠素，進而使得PebS和PebB/A兩條催化途徑均無法合成藻紅膽素，說明第138位的亮氨酸位點在藻紅膽素合成過程中十分關(guān)鍵。

(A. 重組菌株E. coli ph、E. coli ph(M)及空白對照E. coli BL21的熒光發(fā)射圖譜；B. 重組菌株E. coli phS、E. coli ph(M)S及空白對照E. coli BL21的熒光發(fā)射圖譜；C. 重組菌株E. coli phAB、E. coli ph(M)AB及空白對照E. coli BL21的熒光發(fā)射圖譜；D. 重組菌株E. coli ph、E. coli phS、E. coli phAB及空白對照E. coli BL21的熒光發(fā)射圖譜重組菌株。A. Fluorescence emission spectrum of recombinant strains E. coli ph, E. coli ph(M) and E. coli BL21; B. Fluorescence emission spectrum of recombinant strains E. coli phS, E. coli ph(M)S and E. coli BL21; C. Fluorescence emission spectrum of recombinant strains E. coli phAB, E. coli ph(M)AB and E. coli BL21; D. Fluorescence emission spectrum of recombinant strains E. coli ph, E. coli phS, E. coli phAB and E. coli BL21.)

與天然藻紅蛋白(EX：496 nm，EM：580 nm)相比，重組藻紅蛋白的熒光激發(fā)波長(EX：420 nm)發(fā)生了藍移，而熒光發(fā)射波長(EM：595 nm)發(fā)生了紅移，這可能是由于體外重組的藻紅膽素與天然藻紅膽素在結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成上有所差異，因此其光譜性質(zhì)也存在不同。對于天然的R-藻紅蛋白來說，其在580 nm處的單個熒光最大值是從PUB到PEB發(fā)色團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的結(jié)果[11]，而在重組藻紅蛋白中由于PUB的缺失，可能并不存在這種能量轉(zhuǎn)移。

此外，重組菌株E.coliphAB和E.coliphS在630 nm處還檢測到一個熒光峰(見圖6D)，推測該熒光發(fā)射峰可能是藻紅膽素合成過程中的中間體。藻紅膽素合成過程首先是由血紅素加氧酶HO-1催化血紅素形成膽綠素，進而在鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶催化下生成藻紅膽素。在體外重組表達過程中，各種酶的表達水平可能會不均衡，從而導(dǎo)致不完全的中間體產(chǎn)生。

目前，多種血紅素加氧酶已被人們獲得：如動物中的微粒體血紅素加氧酶[46]，某些紅藻、藍藻等藻類及高等植物中的血紅素加氧酶[47]等，本文對龍須菜血紅素加氧酶基因ho-1的克隆及研究進一步加深了對藻類中HO的了解，說明了HO在結(jié)構(gòu)上的保守性及其在藻紅膽素正常合成中的關(guān)鍵作用，為之后研究藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)、合成途徑、光譜性質(zhì)及聚集狀態(tài)奠定基礎(chǔ)；其強大的光學(xué)活性和良好的應(yīng)用前景也為后續(xù)重組藻紅蛋白的研究帶來信心。