非結(jié)核分枝桿菌肺病治療藥物研發(fā)的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

鄭璐瑤 陸宇 陳效友

目前，非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)肺病的年患病率逐年增加，據(jù)Ratnatunga等[1]預(yù)測，2020—2040年NTM感染患者將上升至6446例/年。截至目前已經(jīng)鑒定的NTM有190余種，其中有數(shù)十種可使人體致病[2]。NTM對經(jīng)典的抗結(jié)核分枝桿菌藥物反應(yīng)欠佳，總體應(yīng)答率大約為50%[3]，常常導(dǎo)致疾病進展和擴散。目前臨床上常用的治療方案通常是基于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的三藥及三藥以上聯(lián)合治療方案，治療18～24個月[2]，但治療成功率平均也只有66%[4]，并且有一定的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)為耐藥的概率[5]。因此，我們?nèi)孕璨粩嗵剿髋c研究新的可用于抗NTM的藥物及治療方案。尋找新的藥物和方案有兩條途徑：第一條途徑是在目前已有的抗菌藥物中尋找對NTM具有殺滅作用的藥物或化合物，但它們中僅有少部分藥物具有抗NTM活性，且這些藥物或化合物大多還處于臨床前階段，進入臨床研究階段的較少。第二條途徑就是開發(fā)新的針對NTM特有靶點的藥物，但由于NTM具有自身特殊的生理特點，且開發(fā)過程也存在重重困難，新藥研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

NTM肺病治療藥物的研發(fā)情況

雖然美國胸科學(xué)會和英國胸科學(xué)會已經(jīng)出版了NTM診療指南，但其中推薦的藥物或治療方案在很大程度上還是經(jīng)驗性的[5-6]，且沒有針對不同NTM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案或有效藥物。所以，我們還需要不斷探索新的可用于NTM肺病的有效藥物并加入到化療方案中。

一、臨床階段藥物

1.利福布汀(rifabutin，Rfb)：Rfb在體外及巨噬細胞內(nèi)對包括耐藥株在內(nèi)的膿腫分枝桿菌(MABS)[最低抑菌濃度(MIC)為3 μg/ml，最低殺菌濃度(MBC)為6 μg/ml][7]、堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌(MAC)均有抗菌活性[8-9]，它和克拉霉素(clarithromycin，Clr)、替加環(huán)素、乙胺丁醇及亞胺培南具有協(xié)同殺傷作用[10-11]，或許可以組成新的聯(lián)合用藥方案。在MAC小鼠模型中，Rfb并沒有增加莫西沙星、阿奇霉素和乙胺丁醇單藥或藥物聯(lián)合方案的殺菌作用[12]，但在MABS小鼠模型中，Rfb在低濃度時就可以達到與Clr相同的殺菌效果[13]。此外，Ramis等[14]發(fā)現(xiàn)，Rfb的衍生物Rfb4、Rfb10、Rfb11同樣具有抗MABS的活性，可作為未來藥物研發(fā)的候選化合物。目前，國內(nèi)外正在進行幾項Ⅲ期臨床試驗(NCT00001030、NCT00002101、NCT00001047、NCT04310930、NCT00002122)，評價Rfb對鳥分枝桿菌肺病(MAC-PD)和膿腫分枝桿菌肺病(MABS-PD)的治療效果。

2.氯法齊明(clofazimine，Cfz)：近年的體外研究表明，Cfz對多種NTM具有抗菌活性，其作用機制被認(rèn)為是抑制分枝桿菌的氧化還原鏈或破壞菌體細胞膜。大多數(shù)臨床分離株MIC≤1 mg/L(對于快生長群MIC≤1 mg/L；慢生長群MIC≤0.25 mg/L)[15]，并且Cfz可預(yù)防阿米卡星(amikacin，Am)或Clr單藥引起的復(fù)發(fā)。在小鼠模型研究中，Cfz治療能夠顯著降低小鼠肺組織中的細菌負荷[16]。在MAC-PD和MABS-PD患者中，聯(lián)合Cfz的治療方案痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率比單藥治療方案高60%以上[17]，在使用過程中幾乎不需要監(jiān)測[18]，故未來或許可以成為NTM治療方案中的一員。目前有兩項臨床試驗(NCT02968212和NCT04310930)分別評估其對MAC-PD和MABS-PD的治療效果。

3.貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)：Bdq屬于一種二芳基喹啉類藥物，通過靶向作用于分枝桿菌的ATP合成酶，阻止分枝桿菌利用ATP產(chǎn)生能量而發(fā)揮抗菌作用。多項體外研究顯示，Bdq在體外環(huán)境下對快速生長和緩慢生長的分枝桿菌均有較好的抗菌活性(MIC在0.03～0.5 μg/ml之間)[19-20]。與單藥相比，Bdq和Cfz的聯(lián)合用藥對MABS和MAC的體外殺菌作用更強[21]。Bdq在小鼠模型中表現(xiàn)為抑菌效果[22]，但Philley等[23]在對難治性MAC-PD和MABS-PD患者的評估中發(fā)現(xiàn)，含Bdq的治療方案在治療后6個月有良好的臨床反應(yīng)。目前關(guān)于Bdq對MABS的作用已進行到了Ⅲ期臨床試驗(NCT04310930)，今后或許可以作為強有力的抗菌藥物加入到NTM肺病的治療方案中。

4.Am：相比其他氨基糖苷類抗生素而言，Am可以以更小的劑量達到同樣的殺菌效能，并且作用時間也更長，它對MAC、MABS和其他NTM菌種的臨床分離株顯示出很好的體外活性[24-25]。在C57BL/6J小鼠模型中，Am相比Clr、Bdq、Clr+Am+Bdq三聯(lián)劑具有更強的殺菌活性[22]。臨床試驗(NCT01315236和NCT02344004)證明在NTM肺病患者的基線治療方案中加入脂質(zhì)體Am痰菌陰轉(zhuǎn)率更高(32%vs. 9%)[26-27]。目前兩項臨床試驗(NCT00000641和NCT04310930)正在進行，以評估其對HIV感染者的彌散性NTM或MABS感染患者的療效。

二、臨床前階段藥物

1.PIPD1和吲哚-2-甲酰胺：PIPD1和吲哚-2-甲酰胺都是分枝桿菌膜蛋白3(mycobacterial membrane protein large 3，MmpL3)的抑制劑，可干擾分枝桿菌細胞壁的合成。PIPD1對MABS和恥垢分枝桿菌均具有較高活性(MIC為0.125～1 μg/ml，MBC為0.125～0.5 μg/ml)[28-29]；此外，PIPD1還能夠進入小鼠和人類巨噬細胞并阻止細菌復(fù)制[28]。而在Kozikowski等[30]的研究中，吲哚-2-甲酰胺及其部分先導(dǎo)化合物對MABS的MIC可達到0.125 μg/ml。目前二者還處于臨床前階段，其治療潛力有待于進一步發(fā)掘。

2.惡唑烷酮類抗生素：泰地唑利(tedizolid，TR-700)是一種新型的甲基四唑基惡唑烷酮，它對線粒體蛋白合成有更強的抑制作用[31]，MIC是利奈唑胺的1/2～1/16[32-33]，對一些利奈唑胺耐藥菌株也具有殺菌活性[34]，同時由于利奈唑胺的長期應(yīng)用會導(dǎo)致骨髓毒性增加，故TR-700可能是利奈唑胺的良好替代品[35]。

LCB01-0371是新型惡唑烷酮類抗生素，它在體內(nèi)具有較高的水溶性，并具有良好的吸收、分布、代謝、排泄和較低的毒性。Kim等[36]發(fā)現(xiàn)，LCB01-0371在體外和巨噬細胞感染模型中對膿腫分枝桿菌有效，同時LCB01-0371還可以抑制Am、頭孢西丁和Clr耐藥的MABS菌株的生長。DA-7867 和DA-7157也是惡唑烷酮類化合物，二者對快生長菌群和慢生長菌群的所有測試菌種的MIC90均<8 μg/ml。對于堪薩斯分枝桿菌和海藻分枝桿菌，二者的MIC90均<0.5 μg/ml[32]。這些結(jié)果證明了這些化合物的抗NTM潛力。

3.β-內(nèi)酰胺類抗生素及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑：β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑中僅有包括亞胺培南、頭孢西丁及阿維巴坦在內(nèi)的少數(shù)藥物對NTM有體外抗菌效果。在體外實驗中，亞胺培南及頭孢西丁均對MABS有殺傷效應(yīng)[37]，而阿維巴坦(4 μg/ml)可將碳青霉烯類抗生素對MABS的MIC降低至1/2～1/32[38-39]。在斑馬魚動物模型中，阿維巴坦也可有效抑制MABS的生長[40]?？梢?，二者聯(lián)合或開發(fā)二者的聯(lián)合制劑治療NTM肺病具有很好的研究價值。

4.SQ-641：是所有新型核苷抗生素capuramycin的類似物中殺菌活性最強的化合物，對于MAC和MABS的MIC均小于1 μg/ml。對于恥垢分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌的MIC在1～4 μg/ml之間[41]。Dubuisson等[42]還證明，SQ-641與乙胺丁醇在MAC和恥垢分枝桿菌中存在協(xié)同作用，其與Rfb和鏈霉素在MABS中存在協(xié)同作用。但目前尚無SQ-641的體內(nèi)殺菌作用的數(shù)據(jù)。

5.CPZEN-45：CPZEN-45可以靶向作用于十一烯基磷酸-GlcNAc-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(TagO)，從而抑制細菌細胞壁合成。研究表明，CPZEN-45對于NTM有一定的活性，尤其是緩慢生長型，如MAC，其MIC在0.2～1.56 μg/ml之間[43]。目前關(guān)于CPZEN-45的研究雖然還處于臨床前階段，但是它存在很大的開發(fā)潛能[44-46]，有望在未來成為抗分枝桿菌的新型藥物選擇。

6.D-環(huán)絲氨酸：D-環(huán)絲氨酸是一種氨基酸衍生物，通過抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成，造成細菌細胞壁缺損。在Cowman等[47]的研究中，2637株NTM分離株98%以上均對D-環(huán)絲氨酸敏感，Khosravi等[48]發(fā)現(xiàn)D-環(huán)絲氨酸對MABS及偶發(fā)分枝桿菌感染有較好的療效，且可能與Clr存在協(xié)同作用，或許可作為MABS感染治療方案的候選藥物之一。

7.普托馬尼(pretomanid，PA-824)：PA-824是結(jié)構(gòu)上與Bdq相似的前體藥物，它可以同時作用于分枝桿菌細胞壁及呼吸鏈，對復(fù)制型和非復(fù)制型、厭氧及頑固性分枝桿菌都有抗菌作用[49-50]。但目前PA-824的體外藥效學(xué)評價結(jié)果并不滿意(對堪薩斯分枝桿菌的MIC為12.5 mg/L，潰瘍分枝桿菌為16 mg/L，而對MAC、MABS均大于100 mg/L)[51]，目前也無相關(guān)臨床研究。

8.DC-159a：DC-159a是新一代8-甲氧基氟喹諾酮，它的抗NTM活性是目前可用的氟喹諾酮類藥物中最好的，對堪薩斯分枝桿菌和福特分枝桿菌，MIC分別為0.125 μg/ml和0.25 μg/ml[51]，對MAC的MIC通常是其他氟喹諾酮類藥物的1/2～1/16[52]。但是，它對其他類型的NTM抗菌作用欠佳，并且尚無針對NTM感染的體內(nèi)藥效數(shù)據(jù)。

9.TP-271：TP-271是由Tetraphase Pharmaceuticals(USA)研發(fā)的四環(huán)素類抗生素，具有強大的抗NTM活性，MABS的MIC為0.5 μg/ml；偶發(fā)分枝桿菌的MIC為0.03～0.06 μg/ml[53-54]。但是尚無針對NTM的體內(nèi)療效數(shù)據(jù)。

NTM肺病治療藥物研發(fā)的挑戰(zhàn)

目前，臨床上亟需找到更有效、更安全的藥物或方案，包括具有廣譜抗NTM活性、理想生物利用度的藥物。然而，NTM種類繁多，它們由于自身結(jié)構(gòu)的特點普遍存在抗藥性，又在致病性、毒力、傳播方式和抗生素敏感性方面各有不同，這些差異甚至可以存在于同一種NTM的不同亞種中。對于這些微生物和它們與人體相互作用機制的研究尚不充分。由于NTM菌體的特殊性和新藥研發(fā)的諸多難點，這種目標(biāo)并不容易實現(xiàn)。

一、NTM菌體的特殊性

1.生物膜：NTM會形成一層生物膜，這層生物膜是細菌附著在體外或體內(nèi)固體表面時形成的膜狀的自我保護的三維結(jié)構(gòu)[55]，由細胞外基質(zhì)和微菌落組成[56]。生物膜的存在，給予了細菌抵御外界不良環(huán)境的屏障，也使得細菌具備了一定的免疫逃逸能力，即它可以避免細菌受到宿主的防御系統(tǒng)反應(yīng)和化學(xué)藥物的攻擊，與游離細菌相比，生物膜內(nèi)細菌的MIC可高出102～103倍[57]。Fux等[58]研究表明，分枝桿菌在生物膜形成的不均勻的微環(huán)境中異步生長，即存在不對稱細胞分裂和細胞間隨機基因傳播而發(fā)生耐藥。此外，NTM在體內(nèi)生長時，細胞酪狀碎屑、機體呼吸系統(tǒng)分泌的黏液及生物膜混合物導(dǎo)致作用于NTM菌體的藥物濃度極低，且促進“饑餓”狀態(tài)的NTM減慢代謝甚至休眠，使其對抗菌藥物敏感性進一步下降。

2.細胞壁：同結(jié)核分枝桿菌類似，NTM有復(fù)雜的富含脂質(zhì)的細胞壁，導(dǎo)致其疏水性強，不利于水溶性藥物進入，且細胞壁上的孔蛋白少，導(dǎo)致細菌營養(yǎng)供給欠佳、代謝不活躍而對抗生素反應(yīng)差[59]。NTM細胞壁上還存在可以修飾抗菌藥物及其靶點的系統(tǒng)，以及大量的藥物外排泵，如efp A(RFP)、Ifr A、efp A、Pst B(FQs)、tet V、tap (AGs)等[60-61]，這種內(nèi)在的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可在生理上保護細菌免受有毒分子的侵害。

3.其他特點：NTM還有一些特點導(dǎo)致藥物療效不佳。(1)獲得性耐藥和誘導(dǎo)耐藥：獲得性耐藥的分子基礎(chǔ)是基因突變，突變基因編碼的各種酶可通過藥物靶點修飾等途徑來降解抗生素或降低藥物親和力。誘導(dǎo)耐藥的最經(jīng)典的例子就是在一些NTM如MABS中，紅霉素核糖體甲基化酶(erm)可被大環(huán)內(nèi)酯類抗生素誘導(dǎo)表達，erm能特異性地甲基化23S rRNA的2058位腺嘌呤，導(dǎo)致菌體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[60]；(2)在低營養(yǎng)、低氧條件下，NTM可改變?yōu)榉窃鲋碃顟B(tài)，而對藥物呈高耐受性，抗生素不能破壞其細胞內(nèi)成份[61]；(3)NTM常與HIV等其他病原體合并感染。

二、新藥研發(fā)的挑戰(zhàn)

與結(jié)核病相比，NTM藥品管道非?？杖保惹行枰_發(fā)抗NTM藥品[3]。但是從最初的篩選到最終產(chǎn)品上市是一個復(fù)雜的過程，一種新藥上市平均需要10～15年的時間，超過10億美元才能進入藥房[62]，可見，抗NTM的新藥研發(fā)仍存在諸多挑戰(zhàn)。

1.重視和投入不足：NTM感染后起病隱匿，癥狀多類似結(jié)核病或者其他呼吸系統(tǒng)疾病，患者在被診斷為NTM肺病之前通常會有數(shù)年的癥狀，且由于檢測設(shè)備和條件等限制，存在較高的誤診率[63]，故大多數(shù)流行病學(xué)專家對NTM肺病的流行調(diào)查結(jié)果也僅報告了不完全的患病率數(shù)據(jù)[64]。流行病學(xué)證據(jù)的不足，導(dǎo)致對NTM肺病的重視度和投入還遠遠不夠。

2.藥物作用靶點篩選困難：開發(fā)新藥最重要的步驟之一就是作用靶點的識別和驗證，也就是說要發(fā)現(xiàn)對NTM有活性的化合物，需要進行全基因組測序、突變的篩選和生化分析，并檢索包括出版物和專利信息、基因表達數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)基因表型和化合物譜數(shù)據(jù)在內(nèi)的各種生物學(xué)信息[65]，以發(fā)現(xiàn)有效、安全，同時還要滿足臨床和商業(yè)需求的命中物。當(dāng)藥物作用靶點確定以后，還需要通過化學(xué)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因、反義核酸技術(shù)等方法對該靶點進行驗證[62]。而NTM的致病菌種/亞種數(shù)目龐大，想要對每一種菌都進行靶點篩選是不可能的，但即使只對高致病率的菌種進行篩選也需要投入大量的人力和物力。

3.化合物篩選命中率低：作用靶點驗證后就是化合物的篩選環(huán)節(jié)，即從化合物庫中篩選出具有抗NTM活性并且可重復(fù)驗證其活性的化合物。篩選方法包括高通量篩選(HTS)、虛擬藥物篩選、結(jié)構(gòu)輔助藥物設(shè)計、分割片段篩選等[62, 66]，但是命中率卻很低。最近Aziz等[67]對2700種FDA批準(zhǔn)的針對膿腫支原體的藥物進行篩選，僅有約1%的命中率。

4.藥理學(xué)評價困難：確定候選藥物以后，就需要在體外和體內(nèi)進行藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的評價，這在抗NTM藥物研發(fā)過程中又是一大難題。首先，對于NTM來說，評價藥物的殺菌活性時菌種選擇、培養(yǎng)條件等都會影響最終的結(jié)果[68]，并且目前還沒有成熟的體外藥效學(xué)評價方法，利用結(jié)核分枝桿菌體外MIC測定方法來評價抗NTM藥物的藥效學(xué)結(jié)果與實際臨床療效之間相關(guān)性差。其次，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)最重要的先決條件之一是能夠獲得模擬人類疾病狀況的動物模型。目前并沒有穩(wěn)定的模型建立方法，使得我們無法通過動物模型評估各種藥物或化合物在NTM感染中的藥效學(xué)。

5.成藥困難：NTM肺病的治療療程一般在1年以上，為了使患者有足夠的依從性，通常最好為口服劑型，還要滿足足夠高的生物利用度及胃腸耐受性。與此同時，大部分抗菌藥物都是經(jīng)肝臟P450酶代謝，為了減少藥物間相互作用及競爭抑制，候選化合物還要根據(jù)代謝途徑進行挑選。

展 望

近年來，NTM肺病的發(fā)病率逐漸上升，目前臨床推薦的治療方案雖然總體療效要優(yōu)于經(jīng)典的抗結(jié)核治療方案，但成功率仍然很低，因此需要找到更有效的藥物或藥物組合來對抗NTM感染。若現(xiàn)有藥物不能達到這些要求，那么就需要研發(fā)新的藥物。目前抗NTM新藥研發(fā)的挑戰(zhàn)主要在于克服NTM先天遺傳和生理特性導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象和研發(fā)過程中的種種困難。面對這些挑戰(zhàn)，一個可能的解決辦法是尋找新的具有協(xié)同作用的藥物組合，但更多的是需要政府部門加大對新藥研發(fā)的投入和科研人員對NTM的生理特性和耐藥機制的進一步研究。雖然目前克服這些挑戰(zhàn)似乎是一項艱巨的任務(wù)，但是不同醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)都在不斷進步，我們相信，隨著人們對NTM的了解不斷加深，越來越多的研究正在進行中，對NTM肺病的重大治療進展將在未來幾年中實現(xiàn)。